표준 카운트 한천은 다른 음식 중 마시는 물, 폐수, 유제품 음료의 샘플에서 호기성 미생물 부하 존재의 정량을 위해 설계된 고체, 비 선택적 배지입니다. 이 매체는 English Plate Count Agar의 약어로 PCA agar라고도합니다. Buchbinder, Baris 및 Goldstein이 1953에서 만들었습니다.
표준 카운트 한천 배지는 효모 추출물, 트립 테인, 포도당, 한천 및 증류수로 구성됩니다. 이 제형은 요구되지 않는 현재의 호기성 미생물 부하를 개발할 수있는 기본적인 영양 성분을 포함합니다.
표준 한천 계수에서 CFU 계수를위한 소수 희석. 출처 : Quentin Geissmann
배지에 억제제가 포함되어 있지 않기 때문에 박테리아가 제한없이 성장할 수 있으므로 일반적인 콜로니 계수에 이상적입니다. 그러나, 플라크 정량화 기술은 존재하는 모든 박테리아를 검출하는 것이 아니라 시드 된 표준 계수 한천이 적용되는 환경 조건 하에서 성장할 수있는 박테리아 만 검출합니다.
이러한 의미에서 플레이트 정량화 기술은 일반적으로 호기성 중온 성 유형의 박테리아, 즉 최적의 성장 온도가 37 ° C 인 25 ~ 40 ° C의 온도에서 성장하는 박테리아의 양을 결정합니다. .
이 세균 군은 인간을위한 대부분의 병원성 세균이 그곳에서 발견되기 때문에 매우 중요합니다.
때때로 식품에 존재하는 호 인성 박테리아의 양을 정량화하는 것이 흥미로울 수 있다는 점에 유의해야합니다. 이 박테리아는 저온 (<20 ° C)에서 자라며 냉장 상태에서도 식품을 더 빨리 분해하는 원인이됩니다.
마찬가지로, 50 ° C ~ 80 ° C 이상의 범위에서 발생하는 호 열성 박테리아는 통조림 식품과 같은 특정 유형의 식품에서 중요 할 수 있습니다.
미생물 정량화는 샘플 그램 또는 밀리 리터당 콜로니 형성 단위 (CFU)로 표현됩니다.
기초
표준 계수 배지는 효모 추출물, 트립 테인 및 포도당이 좋은 미생물 성장에 필요한 영양소를 제공하므로 까다 롭지 않은 호기성 박테리아의 성공적인 성장을 허용하도록 설계되었습니다.
반면, 배지는 옅은 색과 투명한 외관을 가지고 있기 때문에 깊은 파종법 (접시 주입)으로 개발 된 집락의 시각화에 이상적입니다.
Drigalski spatula 표면 파종 방법에 의한 집락 계수도 가능합니다.
미생물 부하가 높으면 CFU를 계산할 수 있도록 연구 샘플의 소수 희석을해야합니다.
이 배지는 미국 공중 보건 협회 (APHA)에서 호기성 중엽 수를 권장합니다.
예비
탈수 배지 23.5g을 달아 증류수 1 리터에 녹인다. 완전히 녹이려면 혼합물이 끓을 때까지 자주 저어 주면서 가열해야합니다. 후속 단계는 사용할 파종 기술에 따라 다릅니다.
pour-plate 기법의 경우
시험관에 12 ~ 15ml를 분주하여 분배합니다. 그 후 121 ° C의 오토 클레이브에서 15 분 동안 멸균합니다. 블록 형태로 수직으로 굳어지게합니다. 사용할 때까지 냉장고에 보관하십시오.
사용할 때 플러그를 녹입니다. 녹 으면 샘플이 준비되는 동안 44-47 ° C의 수조에 보관하십시오.
표면 파종 용
121 ° C의 오토 클레이브에서 배지를 멸균 한 다음 멸균 페트리 접시에 20ml를 배포합니다. 사용할 때까지 굳어 뒤집어 냉장고에 보관하십시오.
사용하기 전에 템퍼 플레이트. 배지의 pH는 7.0 ± 0.2 여야합니다.
사용하다
Standard Count Agar는 물과 식품의 미생물 학적 분석 동안 호기성 중온 성 계수 기법에 사용됩니다. 호기성 중엽 수는 연구중인 샘플의 위생 품질을 결정하기 때문에 필요합니다.
이 기술 (이 매체 사용)을 적용하면 정량화를 위해 분리 된 콜로니를 거시적으로 시각화 할 수 있습니다.
플레이트 타설 기술 (깊이 파종)
-방법
이 기술은 다음으로 구성됩니다.
1) 존재하는 박테리아를 재분배하기 위해 샘플을 균질화합니다.
2) 초기 현탁액은 90ml의 희석제 ( 10-1 )에 10gr 또는 10ml의 샘플 비율을 고려하여 멸균 된 병 또는 백에 만들어집니다 .
3) 초기 현탁액부터 시료의 종류에 따라 적절한 십진 희석이 이루어집니다. 예 : (10 -2 , 10 -3 , 10 -4 ). 희석은 펩톤 수 또는 인산염 완충액으로합니다.
이를 위해 초기 현탁액 1ml를 취하여 9ml의 희석제에 넣고 필요한 경우 희석을 계속하고 이제 10-2 희석액 1ml를 취 합니다.
4) 각 희석액 1ml를 취하여 빈 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
5) 각 판에 12 ~ 15ml의 표준 한천을 첨가하여 미리 녹여서 44 ~ 47 ° C에 침전시킨다.
6) 한천을 따라 시료가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 회전시키고 고형화되도록합니다.
7) 플레이트를 뒤집고 24 ~ 48 시간 동안 호기 생물에서 37 ° C에서 배양합니다.
8) 시간이 끝나면 플레이트를 검사하고이를 허용하는 희석액으로 콜로니를 계산합니다. 30에서 300 CFU 사이의 플레이트가 카운트를 위해 선택됩니다.
계수는 수동으로 수행하거나 식민지 카운터 장비를 사용할 수 있습니다.
샘플 ml 당 허용되는 값은 적용되는 규정에 따라 국가마다 다를 수 있습니다.
-UFC 계산
일반 계산은 다음 공식을 사용하여 수행됩니다.
CFU 정량화의 일반적인 계산 공식. 출처 : National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). 식품의 미생물 학적 분석, 공식 분석 방법론, 지표 미생물. 2014 년 3 권. 사용 가능 : anmat.gov.ar
결과를 1 자리 또는 2 자리 숫자로 표현하고 적절한 밑수 10을 곱합니다. 예 : 결과가 16,545 인 경우 세 번째 숫자를 기준으로 17,000으로 반올림되고 1.7 x 10 4 로 표현됩니다 . 이제 결과가 16,436이면 16,000으로 반올림하고 1.6 x 10 4를 표현 합니다.
표면 파종 기술
-방법
-액체 인 경우 직접 시료 0.1ml, 초기 현탁액 10-1 또는 연속 희석액 10-2 , 10-3 등을 표준 카운트 한천 플레이트 중앙에 안내합니다.
-Drigalski spatula 또는 L 자형 유리막대로 시료를 골고루 뿌린 후 10 분 동안 그대로 두십시오.
-플레이트를 뒤집고 37 ° C에서 24 ~ 48 시간 동안 호기성 배양합니다.
-콜로니 수를 세고 20-250 CFU 범위에있는 플레이트를 선택합니다.
-UFC 계산
계산을 위해 역인 희석 계수가 적용됩니다. 숫자는 유효 숫자 2 개 (세 번째 숫자에 따라 반올림)로 반올림되고 10 진법으로 표현됩니다. 예를 들어 희석하지 않은 샘플에서 224 CFU (10 -1 ) 가 계산 되면 22 x 10 1 CFU가보고됩니다. 그러나 수치가 225 인 경우 23 x 10 1 CFU가보고됩니다.
이제 10-3 희석에서 199 CFU가 계산 되면 20 x 10 4 CFU가보고되지만 동일한 희석에서 153 CFU가 계산되면 15 x 10 4 CFU가보고됩니다.
QA
표준 카운트 배양 배지는 다음과 같은 알려진 인증 된 균주를 사용하여 평가할 수 있습니다 : Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.
배양액이 최적의 조건이면 일정한 수율을 얻을 수있는 L. fermentum을 제외한 모든 경우에서 만족스러운 성장이 기대됩니다.
배양 배지의 무균 성을 평가하려면 각 준비된 배치 (접종하지 않음)의 플레이트 1 개 또는 2 개를 호기 성균 상태에서 24 시간 동안 37 ° C에서 배양해야합니다. 이 시간이 지나면 배지에서 성장이나 색 변화가 관찰되지 않아야합니다.
한계
-한천을 두 번 이상 녹이지 마십시오.
-준비된 배지는 냉장고에 보관하고 빛으로부터 보호하는 한 최대 3 개월까지 사용할 수 있습니다.
-이 배지는 까다로운 혐기성 미생물에 적합하지 않습니다.
참고 문헌
- National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). 식품의 미생물 학적 분석, 공식 분석 방법론, 지표 미생물. 2014 년 3 권. 사용 가능 : anmat.gov.ar
- Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009. http://f-soria.es에서 다운로드 가능
- Conda Pronadisa Laboratories. APHA 및 ISO 4833에 따른 표준 방법 한천 (PCA). 사용 가능 : condalab.com
- 브리타니아 연구소. 한천 플레이트 수. 2015. 사용 가능 : britanialab.com
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B 및 Velázquez O. 2009. 식품의 미생물 학적 분석 기법. 2nd ed. UNAM 화학 학부. 멕시코. 사용 가능 : depa.fquim.unam