WRIGHT의 얼룩 : 이론적 근거, 재료, 기술 및 용도 - 생물학

라이트 얼룩 Romanowsky 얼룩을 기반으로 1902 년에 미국의 병리학 자 제임스 호머 라이트가 만든 염색 기법입니다. Romanowsky 얼룩이 불안정했기 때문에 Wright는 메탄올을 용매와 고정 제로 사용했습니다.

이 착색은 다색으로 염료를 흡수하는 구조에 따라 여러 가지 색상을 생성합니다. 이 염색 기술은 차등 백혈구 수를 측정하고 말초 혈액 및 골수에서 적혈구, 혈소판 및 백혈구의 형태를 연구하는 데 널리 사용되었습니다.

Wright의 얼룩으로 얼룩진 다양한 말초 혈액 도말. A. 급성 백혈병 B. 적혈구 내의 Plasmodium vivax. C. Plasmodium falciparum, macrogametocyte. D. 림프구

혈액의 여러 세포주에서 비정상을 볼 수있어 백혈병이나 박테리아 또는 기생충 감염과 같은 질병의 진단을 용이하게하기 때문에 그 적용은 매우 중요합니다.

아마도 이들은이 기술이 사용되는 가장 일반적인 응용 프로그램이지만 유일한 응용 프로그램은 아닙니다. 비강 분비물, 분변 점액, 가래, 피부 샘플 등과 같은 혈액 및 골수 이외의 샘플에도 유용합니다.

Wright 얼룩의 근거

Wright 스테인은 산성 염료 (eosin Y)와 염기성 염료 (메틸렌 블루)의 메틸 알코올 용액과 그 산화 생성물로 구성된 Romanowsky 스테인에서 태어났습니다.

Wright의 염색에 사용 된 염료의 혼합물은 Romanowsky로 알려진 효과를 유발합니다. 즉, 백혈구와 호중구 과립의 핵에 아름다운 보라색을주고 적혈구는 분홍색으로 염색합니다.

Wright 염색의 일반적인 색 영역을 제공하는 구성 요소는 파란색 B와 에오신 Y입니다. 관찰 된 효과는 염료가 화학 구조에 결합하고 파란색 B와 에오신 Y의 상호 작용에 따라 달라집니다.

핵산, 핵 단백질 및 일부 세포 유형의 반응성 미성숙 세포질과 같은 산성 구조는 청색 B (염기 염색)를 수정합니다.

헤모글로빈과 같은 기본 구조는 다른 세포 구조 중에서 분할 된 호산구의 과립이 에오신 Y (산성 염료)와 결합합니다.

염색 결과는 Wright 염료의 pH, 완충액 및 세척액과 같은 다양한 요인에 의해 영향을받을 수 있습니다. 염색 및 고정 시간뿐만 아니라.

따라서 시약 준비의 각 단계는 중요하며 모든 세부 사항에주의를 기울여 수행해야합니다.

기재

라이트의 얼룩. 100 mL의 경우 다음이 필요합니다.

라이트의 얼룩 0.3g을 달아 메탄올 97ml와 글리세롤 3ml를 측정합니다.

예비

모르타르에 Wright의 착색제를 많이 넣고 분말이 완전히 녹을 때까지 글리세롤을 서서히 섞습니다.

그 후, 메탄올을 첨가하고 혼합하여 호박색 병에 붓습니다.

사용하기 전에 용액을 부드럽게 흔들고 여과해야합니다.

버퍼링 된 버퍼 솔루션

1 리터의 증류수에 3.76g 의 하이드로 인산 이 나트륨 (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0)과 2.1g의 인산이 수소 칼륨 (KH ₂ PO ₄ )을 첨가합니다.

모든 시약이 용해 될 때까지 잘 섞으십시오. pH를 7.2로 조정합니다. 유리 병에 붓고 실온에서 보관하십시오.

채색을 수행하는 데 필요한 추가 재료

또한 착색 기술을 수행하려면 다른 재료가 필요합니다. 물체 슬라이드 또는 커버, 착색 브리지, 물 또는 세척 용 완충액이있는 티셔츠, 착색 시간을 유지하는 스톱워치 및 일부 건조 재료 (흡수성 종이, 거즈 또는 면화).

Wright 얼룩의 성분

메탄올

알코올 (메탄올)은 혈액 도말을 슬라이드에 고정시키는 역할을합니다.

기본적으로 응고제 환원, 탈수 및 고정 시약입니다. 따라서 그 기능은 단백질을 응고시켜 불용성으로 만드는 것이지만 실제로는 변성시키지 않습니다.

메탄올은 에탄올보다 더 나은 결과를 제공하기 때문에 모든 실험실에서 가장 널리 사용되는 도말 고정 시약입니다. 이상적인 농도는 99 %입니다.

댐퍼

완충액 (완충 용액)은 염료의 pH를 조절하거나 유지하는 기능을합니다. 7.2로 조절 된 pH는 세포 구조가 염료를 적절하게 흡수 할 수있는 데 필수적이기 때문입니다.

반면에 메탄올 고정 단계는 세포를 탈수시키고 완충액은 세포를 재수 화하는 데 도움이됩니다.

에오신 (Y)

에오신은 산성 염료이기 때문에 빌딩 블록에 친화력이 있습니다. 두 종류의 에오신은 서로 매우 유사한 것으로 알려져 있으므로 둘 중 하나를 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

하나는 에오신 Y, 노란색 에오신 또는 테트라 브로 모 플루오 레세 인이라고하고 다른 하나는 에오신 B, 푸른 빛을 띤 에리트로 신 B 또는 디 브로 모디 니트로 플루오 레세 인이라고합니다. 그러나 에오신 Y가 가장 일반적으로 사용됩니다.

이 염료의 가장 중요한 특성은 음의 극성으로 양전하를 띤 세포 구조에 끌립니다.

메틸렌 블루

기본 채색입니다. 주요 특성은 metachromasia입니다. 즉, 모든 구조가 동일한 색상으로 염색되는 것은 아니며 착색되는 구조의 화학적 구성에 따라 다릅니다.

일부는 밝거나 진한 파란색으로 변하고 일부는 진한 보라색 또는 옅은 라일락으로 변합니다.

기술

1- 슬라이드 또는 커버 슬립에 얇은 필름이 남아 있도록 샘플의 확산을 수행합니다.

2- 약 2 시간 동안 공기 중에서 말리십시오.

3- 샘플의 퍼짐이 위로 향하도록 염색 브리지 또는 염색 트레이에 건조 도말을 놓습니다.

4- 전체 표면이 덮일 때까지 Wright 얼룩으로 시트를 한 방울 씩 덮으십시오. 5-8 분 동안 그대로 두십시오.

5- 얼룩은 가장자리에 넘치지 않고 슬라이드를 완전히 덮어야합니다. 착색 시간 동안 증발하기 시작하면 몇 방울을 더 추가하십시오.

6- 이후 동일한 양의 충격 흡수 장치를 추가하고 특징적인 금속 광택이 나타날 때까지 약간 불어줍니다. 시간 10 ~ 15 분.

7- 시트가 분홍색이 될 때까지 부드러운 흐름을 놓아 수돗물로 씻으십시오.

8- 알코올에 적신 거즈로 슬라이드 뒷면에 붙은 염료를 제거합니다.

9- 현미경으로 볼 수 있도록 침지 오일을 배치하기 전에 얼룩을 아주 잘 말리십시오.

유용

혈액학

말초 혈액 도말 염색, 두꺼운 혈액 도말 검사 및 골수 샘플의 세포 연구에 이상적입니다.

이 염료 조합의 화학적 특성으로 인해 세포 구조를 쉽게 인식 할 수 있으며 존재하는 다양한 유형의 세포를 구별 할 수 있습니다.

콧물

이 기술은 알레르기 성 비염의 진단에서 비강 분비물 (상피 세포, 분절 된 호산구, 다형 핵 세포)의 세포를 식별하는 데 매우 유용합니다.

기생충학

이러한 의미에서 피부 궤양의 피하 세포 조직 조직 세포 내 Leishmania sp 연구에 유용했습니다. 마찬가지로 대변 샘플 (분변 백혈구)에서 백혈구를 식별하는 데 사용됩니다.

이 경우, 대변에 존재하는 백혈구 증가증이 다형 핵인지 단핵인지를 아는 것이 의사에게 중요합니다. 대변 백혈구에서이 발견은 각각 세균 감염인지 바이러스 감염인지를 안내 할 것입니다.

반면에, 혈액에서 순환하는 기생충은 적혈구 내에서 발견되거나 혈장에서 자유로울 수 있습니다. 찾는 기생충은 Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii 및 filarias이며, 수의학에서는 특히 말에서 bebesiosis의 원인 인자 인 Theileria equi와 Babesia caballi를 찾는 데 유용합니다.

Wright 염색과 Giemsa 염색은 정상 세포 구성 요소와 조혈 기생충을 구별 할 수 있습니다. 이를 위해 두 가지 유형의 스프레드를 사용할 수 있습니다.

얇게 퍼짐

혈액은 슬라이드에 얇은 막으로 퍼집니다. 라이트 염색으로 염색되어 핵과 세포질의 특성을 드러냅니다.

두꺼운 방울

이 방법론은 다량의 혈액에서 기생충의 존재를 조사하는 데 사용됩니다.

이를 위해 많은 양의 피가 슬라이드에 놓입니다. 일단 거기에 있으면 다른 슬라이드의 가장자리를 사용하여 중앙에서 바깥쪽으로 더 크고 더 큰 원을 만들어 제세동해야합니다.

마지막으로, 두꺼운 도말 속의 기생충을 관찰하기 위해서는 적혈구를 물로 용해시켜야합니다.

호흡기 감염

객담, 기관지 세척 또는 기관지 폐포 검체에 존재하는 세포가 진단을 확립하는 데 중요하기 때문에 호흡 수준에서이 기술도 유용합니다.

유사하게, 다형 핵 세포와 단핵 세포는 여기서 구별 될 수 있습니다.

세균학

세균학에서이 기술의 사용은 제한적입니다. 왜냐하면 세균 염색에 좋지 않기 때문에 다른 특수 염색 기술이 염색에 사용되는 이유입니다.

그러나 요도 또는 자궁 경부 점막 도말 검사에서 클라미디아 트라코마 티스 봉입체가있는 상피 세포를 검색하는 데 사용되어 왔지만 이것이 최선의 방법은 아니라는 점을 인식해야합니다.

또한 감염된 환자의 적혈구 중에서 Borrelia burgdorferi와 같은 나선형 박테리아를 관찰 할 수 있으며 혈액 도말에서 림프구, 단핵구 또는 호중구의 세포질에서 Ehrlichia sp의 상실 또는 봉입체를 관찰 할 수 있습니다.

균학

Histoplasma capsulatum은 Wright의 염색으로 염색 된 다양한 조직 샘플을 현미경으로 관찰하여 자주 진단되는 병원성 진균입니다.

Wright의 얼룩으로 혈액 샘플의 구조를 어떻게 관찰합니까?

출처 : Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health, Government of Chile. 헤모 그램을 읽기 위해 혈액 도말 염색에 대한 권장 사항.

좋은 염색을위한 권장 사항

혈액 샘플 슬라이드는 자연 건조되어야합니다. 염료를 더 잘 고정하고 과도한 염색을 피하기 위해 얼룩은 가능한 한 얇아 야합니다.

고품질 염색을 위해서는 도말 준비 후 2 시간 이내에 염색하는 것이 좋습니다. 반면에 이상적인 샘플은 항응고제가없는 모세 혈관입니다.

그러나 정맥혈을 사용하는 경우 헤파린이 아닌 항응고제 EDTA로 사용해야합니다. 후자는 세포 구조를 변형시킬 수 있기 때문입니다.

준비된 착색제의 열화를 방지하기 위해 건조한 장소에 보관해야합니다.

세탁 과정에서 중성 pH로 조정 된 물을 사용하는 것이 좋습니다.

마지막으로 실험실에서 사용되는 염색 방법을 수시로 테스트하는 것이 좋습니다.

이것은 품질 관리로서 샘플 또는 확장 된 패턴을 염색하여 수행됩니다. 이 단계는 염색이 제대로 준비되고 염색 시간이 잘 표준화되어 있는지 확인하기 때문에 중요합니다.

패턴 시트의 색상이 좋지 않으면 해결해야 할 문제가 있습니다.

Wright 염색의 일반적인 실수

매우 창백한 염색

매우 창백한 얼룩은 일반적으로 매우 짧은 염색 시간이나 과도한 세척으로 인해 발생합니다. 염료와의 접촉 시간을 늘리거나 세탁 시간을 줄여서 수정합니다.

착색제 침전물

얼룩에 염료 침전물이 있으면 여러 가지 원인이있을 수 있지만 가장 흔한 원인은 여과되지 않은 염료 사용, 고르지 않은 얼룩 다리의 얼룩, 먼지 나 기름으로 더러워진 시트 사용, 잘 씻지 않음입니다. 완전한 염색.

매우 빨간색 또는 파란색 얼룩

버퍼는 염료의 pH를 담당합니다. 표시된 (산성) 미만의 pH로 염색하면 매우 붉은 얼룩이 생깁니다.

염료의 pH가 (알칼리성) 이상이면 매우 푸르스름한 얼룩이 생깁니다.

저장 모드

시약은 실온에서 보관해야합니다.

참고 문헌

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WRIGHT의 얼룩 : 이론적 근거, 재료, 기술 및 용도 - 생물학 - 2026