DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 -)의 형광 특성에 의해 색소의 역할이다 마커 널리 형광 현미경의 분야에서 사용 또는 중에서도 유동 세포 계측법. 방출하는 형광은 밝은 파란색이며 여기는 455-461 nm (UV 광선) 사이에서 발생합니다.
DAPI 염료는 죽은 세포의 세포막을 매우 쉽게 통과 할 수 있습니다. 또한 살아있는 세포의 핵을 염색 할 수 있지만이 경우 농도가 더 높아야합니다.
형광 염료 DAPI의 화학 구조. 출처 : 이미지 : 파일 : DAPI.svg는이 파일의 벡터 버전입니다. 열등하지 않을 때이 래스터 이미지 대신 사용해야합니다. / Richard Wheeler (Zephyris) 편집 된 이미지
염료는 특별한 친화력을 가진 세포 DNA에 접근 할 수 있으며 질소 염기 인 아데닌과 티민에 큰 결합력을 가지고 있습니다. 이러한 이유로 일부 분자 생물학 기술에 매우 유용합니다.
이 화합물은 인돌 염료 그룹에 속하며 특히 아가 로스 겔에서 ethidium bromide 및 propidium iodide보다 DNA에 더 큰 민감성을 갖는 것으로 나타났습니다.
이 형광 염료의 사용은 다음과 같은 용도로 유용하기 때문에 매우 광범위합니다. 세포 사멸 과정 (세포 사멸)에서 DNA의 변화를 연구하고이 과정에서 세포를 탐지합니다. DNA 발자국 사진 용 (DNA 사진 인쇄); 박테리아 오염을 연구하기 위해; 또는 핵 분할을 시각화합니다.
또한 염색체 밴드 연구, Mycoplasmas sp DNA의 검출, DNA- 단백질 상호 작용, 면역 형광에 의한 세포 염색 및 계수, 심지어 성숙한 꽃가루 알갱이의 색을 지정하는 데 사용되었습니다.
형질
DAPI는 화학명 (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)의 약어입니다. 분자식은 C 16 H 15 N 5 입니다. 분자량은 350.3입니다. UV 광선 범위 (345 ~ 358 nm) 근처에서 DAPI-DNA 복합체의 최대 여기가 발생하는 반면 최대 형광 방출은 455-461 nm 사이에서 발생합니다.
이 염료는 노란색 분말로 특징 지워지지 만이 형광 단으로 표시된 구조는 화려한 푸른 빛을 발산합니다.
물에 녹는 화합물이지만 용해를 촉진하기 위해 약간의 열을 가할 수 있습니다. PBS로 희석 할 수 있지만 직접 용해 할 수는 없습니다.
염료가 준비되면 2 ~ 8 ° C (냉장고)의 어두운 곳, 즉 빛으로부터 보호해야합니다. 이러한 조건에서 염료는 3 주 또는 수개월 이상 안정적입니다.
빛으로부터 보호하지만 실온에 방치하면 안정성이 2 ~ 3 주로 떨어지지 만 직사광선에 노출되면 열화가 매우 빠릅니다. 더 오래 보관하고 싶다면 분취 량으로 분배하여 -20 ° C에서 냉장 보관할 수 있습니다.
기초
이 염색은 유세포 분석, 형광 현미경 및 중기 염색체 또는 간기 핵의 염색과 같은 주요 분자 생물학 기술에서 핵 카운터 스테인 생성을 기반으로합니다.
이 기술은 작은 홈의 유전 물질 (DNA)에 포함 된 질소 염기 (아데닌 및 티민)에 대한 염료의 높은 친 화성을 기반으로합니다. 세포질 수준에서는 배경이 거의 남지 않습니다.
형광 염료가 DNA의 아데닌 및 티민 영역에 결합하면 형광이 크게 증가합니다 (20 배 이상). 그것이 방출하는 색은 밝은 파란색입니다. 특히, GC (구아닌-사이토 신) 염기쌍에 결합 할 때 형광 방출이 없습니다.
RNA에 대한 친화 성도 가지고 있지만,이 분자에서 가장 높은 에너지 방출이 460에서 발생하는 DNA와 달리 다른 파장 (500nm)에서 발생하기 때문에 이것은 문제를 일으키지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. nm. 더욱이, RNA에 결합되면 형광의 증가는 20 %에 불과합니다.
DAPI는 살아있는 세포보다 죽은 (고정 된) 세포를 염색하는 데 더 많이 사용됩니다. 왜냐하면 후자를 염색하려면 훨씬 더 높은 농도의 염료가 필요하기 때문입니다. 이것은 세포막이 살아있을 때 DAPI에 훨씬 덜 투과하기 때문입니다.
DAPI 염료는 다중 색상 경험을 위해 적색 및 녹색 형광체와 함께 사용할 수 있습니다.
사용하다
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)는 우수한 형광 단이므로 다양한 기술과 다양한 목적으로 널리 사용됩니다. 다음은 주요 기술에서 DAPI를 사용하는 방법을 설명합니다.
유세포 분석
Gohde, Schumann 및 Zante는 1978 년에 처음으로 DAPI를 유세포 분석 기술에서 형광 단으로 사용하고 제안했으며, DNA에 대한 높은 감도와 높은 형광 방출 강도로 인해 큰 성공을 거두었습니다.
이 기술에서 DAPI를 사용하면 세포주기, 세포 정량화 및 살아있는 세포와 죽은 세포의 염색을 연구 할 수 있습니다.
ethidium bromide, Hoechst oxide, acridine orange 및 propidium iodide와 같은 다른 착색제가 있지만 DAPI는 이전에 언급 한 것보다 광 안정성이 뛰어나 가장 널리 사용되는 것 중 하나입니다.
이 기술의 경우 세포를 고정해야하며,이를 위해 절대 에탄올 또는 4 % 파라 포름 알데히드를 사용할 수 있습니다. 샘플을 원심 분리하고 상층 액을 버리고 5ml의 PBS 버퍼를 15 분 동안 첨가하여 세포를 수화시킵니다.
시간이 경과하는 동안 3 μM 농도의 염색 버퍼 (BioLegend의 FOXP3)로 DAPI 염색을 준비합니다.
샘플을 원심 분리하고 상층 액을 폐기 한 다음 실온에서 15 분 동안 DAPI 용액 1ml로 덮습니다.
적절한 레이저로 샘플을 유세포 분석기로 가져갑니다.
유량 Microfluorometry
DAPI가 사용되는 또 다른 기술은 미트라 마이신이라는 또 다른 형광 단과 함께 유동 마이크로 형광 측정법입니다. 둘 다 엽록체 DNA를 개별적으로 정량화하는 데 유용하지만 DAPI는 T4 박테리오파지 입자를 측정하는 데 가장 적합합니다.
이종 교잡
이 기술은 기본적으로 DAPI가 될 수있는 형광 염료로 표지 된 DNA 프로브를 사용합니다.
샘플은 이중 가닥 DNA를 변성시키고 두 개의 단일 가닥 가닥으로 변환하기 위해 열처리가 필요합니다. 이어서 관심 서열을 갖는 DAPI 표지 된 변성 DNA 프로브와 혼성화됩니다.
나중에 혼성화되지 않은 것을 제거하기 위해 세척하고 DNA를 시각화하기 위해 대조를 사용합니다. 형광 현미경은 하이브리드 프로브를 관찰 할 수 있습니다.
이 기술은 염색체 DNA의 특정 서열을 검출하여 특정 질병을 진단 할 수있는 목적을 가지고 있습니다.
이러한 세포 분자 기술은 핵형 연구에서 세부 사항을 결정하는 데 큰 도움이되었습니다. 예를 들어, 그는 이색 성 영역 또는 DAPI 밴드라고 불리는 아데노신과 티민의 염기쌍이 풍부한 영역을 보여주었습니다.
이 기술은 식물과 동물의 염색체 및 염색질 연구뿐만 아니라 인간의 태아기 및 혈액 병리 진단에도 널리 사용됩니다.
이 기술에서 권장되는 DAPI 농도는 15 분 동안 150ng / ml입니다.
조립 된 슬라이드는 2-8 ° C에서 빛으로부터 보호하여 보관해야합니다.
면역 형광 염색
세포는 4 % 파라 포름 알데히드로 고정됩니다. 다른 얼룩을 사용하려면 DAPI를 마지막에 카운터 스테인으로 남겨두고 세포를 PBS 용액으로 15 분 동안 덮습니다. 시간이지나면서 최종 농도가 300 µM가되도록 PBS로 희석하여 DAPI 용액을 준비합니다.
그런 다음 초과 PBS를 제거하고 5 분 동안 DAPI로 덮습니다. 여러 번 세탁합니다. 슬라이드는 적절한 필터 아래에서 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
안전 시트
이 화합물은 돌연변이 유발 특성이있는 화합물이므로주의해서 취급해야합니다. 폐기 될 수용액에서이 화합물을 제거하기 위해 활성탄이 사용됩니다.
이 시약으로 인한 사고를 방지하기 위해 장갑, 가운 및 보안경을 사용해야합니다. 피부 나 점막과의 접촉이 발생하면 해당 부위를 충분한 물로 씻어야합니다.
이 시약을 입으로 피펫 팅하지 말고 피펫을 사용하십시오.
잘못된 결과를 초래할 수 있으므로 미생물 제제로 시약을 오염시키지 마십시오.
DAPI 얼룩을 권장보다 더 많이 희석하지 마십시오. 얼룩의 품질이 크게 저하됩니다.
시약을 직사광선에 노출하거나 형광을 감소 시키므로 따뜻하게 유지하지 마십시오.
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