포자 염색 : 근거, 기술 및 사용 - 생물학 - 2025

포자 염색 악조건 일부 박테리아 속을 구성하는 저항 구조체 색상을 사용하는 방법이다 이러한 구조는 생존의 한 형태에 해당합니다.

포자를 형성하는 많은 속이 있습니다. 그러나 주된 것은 Bacillus와 Clostridium입니다. 이 속은 인간에게 병원성 종이 있기 때문에 더 관련성이 있다고 간주됩니다.

Shaeffer – Fulton 또는 Wirtz-Conklin 방법에 의한 포자 염색. Wikimedia Commons의 tambe (원래 업 로더)

각 간균은 포자를 생성 할 수 있습니다. 조제 물을 염색 할 때 포자는 바실러스 (내포 자) 내부 또는 외부 (외 포자) 내부에서 발견 될 수 있습니다. 그람 염색과 같은 기존의 박테리아 염색 기술을 사용하면 포자는 무색으로 유지됩니다.

현재 포자의 두꺼운 구조를 관통하여 염색 할 수있는 몇 가지 염색 방법이 있습니다. 이러한 방법론은 매우 다양합니다. 여기에는 Dorner 기법, Möeller 염색 및 Wirtz-Conklin이라고도 알려진 Shaeffer – Fulton 방법론이 포함됩니다.

언급 된 모든 기술 중에서 Shaeffer-Fulton 방법론은 일상적인 실험실에서 가장 널리 사용됩니다. 1930 년에 채색을 만든 두 명의 미생물학자인 Alicia Shaeffer와 MacDonald Fulton의 이름을 따서 명명되었습니다. 그러나이 기술은 1900 년대에 두 명의 세균 학자의 이름을 따서 Wirtz-Conklin으로 명명되기도합니다.

기초

포자는 벽이 매우 두껍기 때문에 기존의 얼룩으로 얼룩지지 않습니다. 포자의 복잡한 구성은 대부분의 착색제의 유입을 방지합니다.

포자를 외부에서 내부로 연구하면 다음과 같은 층이 관찰됩니다. 첫째, 당 단백질에 의해 형성되는 가장 얇은 외층 인 exosporium이 있습니다.

다음으로 고온에 대한 저항력을 제공하는 큐티클과 펩티도 글리 칸으로 구성된 피질이 이어집니다. 나중에 원형질체를 보호하는 바닥의 벽이 있습니다.

포자는 15 % 칼슘과 디피 콜린 산을 포함하는 탈수 구조입니다. 따라서 대부분의 포자 염색 기술은 염료가 두꺼운 구조를 통과 할 수 있도록 열을 가하는 방법에 의존합니다.

포자가 염색되면 염료를 제거 할 수 없습니다. Shaeffer – Fulton 기법에서 말라카이트 그린은 식물 세포로 들어가고 열이 가해지면 내생 포자와 외포자를 통과합니다.

물로 세척하면 식물 세포에서 염료가 제거됩니다. 이것은 공작석 녹색 염료가 약간 염기성이므로 식물 세포에 약하게 결합하기 때문에 발생합니다.

대신 포자에서 나올 수 없으며 결국 바실러스는 사 프라 닌으로 반 염색됩니다. 이 기초는 유사한 일이 발생하는 나머지 기술에 유효합니다.

포자 염색 기술

포자 염색을 수행하려면 연구 할 의심스러운 균주의 순수한 배양 물을 얻어야합니다.

배양은 미생물이 포자를 형성하도록 자극하기 위해 24 시간 동안 극한 온도에 노출됩니다. 이를 위해 배양은 44 ° C의 오븐 또는 24 또는 48 시간 동안 냉장고 (8 ° C)에 넣을 수 있습니다.

언급 된 온도에서 너무 오래 방치하면 모든 내생 포자가 이미 바실러스를 빠져 나가기 때문에 외생 포자 만 관찰됩니다.

시간이 끝나면 멸균 생리 용액 몇 방울을 깨끗한 슬라이드에 놓아야합니다. 그런 다음 문화의 작은 부분을 취하고 미세하게 퍼집니다.

그 후 건조 상태로두고 열에 고정하고 아래 설명 된 기술 중 하나로 염색합니다.

Dorner 기술

1- 증류수에 포자 화 된 미생물의 농축 된 현탁액을 시험관에 준비하고 동일한 부피의 여과 된 Kinyoun carbol fuchsin을 추가합니다.

2- 튜브를 끓는 물이있는 욕조에 5 ~ 10 분 동안 넣습니다.

3- 깨끗한 슬라이드에서 이전 현탁액 한 방울을 10 % 니그로 신 수용액 한 방울과 혼합하고 끓여서 여과합니다.

4- 부드러운 열로 빠르게 퍼지고 말립니다.

5- 100X 목표 (몰입)로 검사합니다.

포자는 붉게 물들고 박테리아 세포는 어두운 회색 배경에 거의 무색으로 보입니다.

수정 된 Dorner 기법

1- 포자 화 된 미생물의 현탁액이 슬라이드에 펼쳐져 열에 고정됩니다.

2- 샘플은 carbol fuchsin이 추가 된 여과지 스트립으로 덮여 있습니다. 착색제는 증기 발생이 발생할 때까지 분젠 버너의 불꽃으로 5 ~ 7 분 동안 가열됩니다. 그런 다음 용지가 제거됩니다.

3- 조제 물을 물로 세척 한 다음 흡수지로 건조합니다.

4- 두 번째 슬라이드를 사용하여 니그로 신 또는 바늘을 펴서 10 % 니그로 신의 얇은 필름으로 얼룩을 덮으십시오.

포자와 박테리아에 의해 취해진 착색은 종래 기술에서 기술 된 것과 동일하다.

Shaeffer – Fulton 또는 Wirtz-Conklin 기법

1- 슬라이드에 포자 화 된 미생물의 현탁액으로 미세한 얼룩을 만들고 열에 고정합니다.

2- 5 % 말라카이트 녹색 수용액으로 슬라이드를 덮으십시오 (슬라이드에 여과지를 놓을 수 있음).

3- 분젠 버너의 화염을 가열하여 증기를 방출하고 화염을 제거하십시오. 6 ~ 10 분 동안 작업을 반복합니다. 말라카이트 그린 용액이 시술 중에 너무 많이 증발하면 더 많이 추가 할 수 있습니다.

4- 여과지 (설치된 경우)를 제거하고 물로 씻으십시오.

5- 0.5 % 수성 사 프라 닌으로 슬라이드를 30 초 동안 덮습니다 (이 기술의 일부 변형은 0.1 % 수성 사 프라 닌을 사용하고 3 분 동안 그대로 둡니다).

이 기술을 사용하면 포자는 녹색으로 보이고 간균은 빨간색으로 나타납니다.

어린 배양 균의 내생 포자는 매우 투명하거나 무색으로 보이기 때문에 잘 염색되지 않는다는 단점이 있습니다. 이를 방지하려면 48 시간 배양의 배양을 사용하는 것이 좋습니다.

Möeller 기술

1- 얼룩을 클로로포름으로 2 분 동안 덮으십시오.

2- 클로로포름을 폐기하십시오.

3- 5 % 크롬산으로 5 분간 덮습니다.

4- 증류수로 세척

5- 시트는 carbol fuchsin-fenicada로 덮여 있으며 증기가 방출 될 때까지 Bunsen 버너의 화염에 노출됩니다. 그런 다음 몇 분 동안 불꽃에서 제거됩니다. 작업은 10 분이 완료 될 때까지 반복됩니다.

6- 물로 씻으십시오.

7- 산성화 된 에탄올 (염산 알코올)을 사용하여 변색하십시오. 20 초 또는 30 초 동안 방치됩니다.

8- 증류수로 씻으십시오.

9- 시트를 메틸렌 블루로 5 분 동안 덮어 대조합니다.

10- 증류수로 씻으십시오.

11- 건조시키고 샘플을 현미경으로 가져갑니다.

포자는 빨간색으로 보이고 바실리는 파란색으로 나타납니다. 증기는 독성이 있고 장기적으로 발암 성이있을 수 있으므로 숨을들이 마시지 않는 것이 중요합니다.

열없이 수정 된 Möeller 기술

2007 년에 Hayama와 그의 협력자들은 Möeller 기술을 수정했습니다. 그들은 염료를 가열하는 단계를 제거하고 carbol fuchsin-carbol 용액 10ml 당 계면 활성제 Tergitol 7 2 방울을 첨가하여 교체했습니다. 동일한 결과가 얻어졌습니다.

응용

포자의 착색은 병원균의 존재, 모양, 바실러스 내의 위치 및 식물 세포를 변형시키는 능력이 종을 안내 할 수있는 데이터이기 때문에 병원체를 식별하는 데 매우 귀중하고 유용한 정보를 제공합니다. 특정 장르에 관여합니다.

이러한 맥락에서 포자는 둥글거나 타원형 일 수 있으며, 중앙에 위치 할 수도 있고, 중심, 하위 또는 말단 위치에 위치 할 수도 있습니다.

내생 포자와 외생 포자의 모양과 위치 다이어그램

예

-Clostridium difficile은 바실러스를 변형시키는 말단 위치에 타원형 포자를 형성합니다.

-Clostridium tertium의 포자는 타원형이며 균을 변형시키지 않으며 말단에 위치합니다.

-Clostridium tetani의 내생 포자는 말단이고 바실러스를 변형시켜 드럼 스틱처럼 보입니다.

-Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy 및 C. septicum의 포자는 둥글거나 종말 이하의 타원형이며 바실러스를 변형합니다.

-Clostridium sordelli의 내생 포자는 중앙에 위치하며 약간의 변형이 있습니다.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). 미생물 진단. (5 판). 아르헨티나, 에디토리얼 Panamericana SA

참고 문헌

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. 열을 가하지 않고 세균 포자를 염색하는 단순화 된 기술 제안 – Moeller 방법의 성공적인 수정. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8) : 356-9.
2. Wikipedia 기고자. Moeller 얼룩. Wikipedia, The Free Encyclopedia. 2018 년 11 월 3 일 03:28 UTC. 사용 가능 : en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). 미생물 기술 실험실 매뉴얼. 미생물학 아카데미 기초 과학과. 국립 폴리 테크닉 연구소.
4. "내생 포자." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 2018 년 2 월 25 일 10:20 UTC 2019 년 1 월 10 일, 02:42 : en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J 및 공동 작업자. (2006). Extremadura의 자치 공동체의 노동 인력. 특정 의제 IV. 편집 MAD. 세비야-스페인, 211-212 쪽.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). 전문 실험실 기술자, Galician Health Service (SERGAS). 특정 주제 의제 2. 편집 MAD. 세비야-스페인, pp 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). 미생물 진단. (5 판). 아르헨티나, 에디토리얼 Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott 미생물 진단. 12 ed. 아르헨티나. 편집 Panamericana SA