그람 염색 : 근거, 재료, 기술 및 용도 - 생물학 - 2025

그람 염색은 가장 간단하고 유용 염색 진단 미생물학의 기술. 이 기술은 1884 년 덴마크 의사 Hans Christian Gram에 의해 만들어졌으며, 그는 세포벽의 구성에 따라 박테리아를 그람 양성과 그람 음성으로 분류했습니다.

이 기술은 1921 년 Hucker에 의해 시약을 안정화하고 염색 품질을 개선하기 위해 특정 수정을 거쳤으며, 이것이 그람 염색이 Gram-Hucker라고도 알려진 이유입니다.

그람 염색으로 얼룩진 다양한 얼룩. A. 그람 양성 구균. B. 그람 음성 봉. C. 그람 양성, 다형 핵 및 단핵 막대. D. 효모.

이 기술을 사용하면 미생물의 모양, 즉 cocci, bacilli, coccobacilli, 다형성, 필라멘트 등의 미생물 형태를 관찰 할 수도 있습니다. 공간에서의 분포 : 클러스터, 체인, 분리, 쌍, 4 등분 등.

세균 감염이 의심되는 경우,받은 대부분의 샘플을 슬라이드에 도말하고 현미경 검사를 위해 그람 염색을해야합니다.

그람 보고서는 최종 배양 결과를 얻기 전에 어떤 유형의 미생물이 감염의 원인이 될 수 있는지 의사에게 안내합니다.

어떤 경우에는 환자의 생명이 매우 훼손되기 때문에 의사는 미생물의 식별을 기다리는 동안 경험적 치료를 위해 그람 보고서가 긴급히 필요합니다.

예를 들어, 그람에서 뇌척수액에 그람 양성 구균이 있음이 밝혀지면 의사는 이에 대해 확립 된 프로토콜에 따라 이러한 유형의 박테리아를 제거하는 항생제로 초기 치료를 안내 할 것입니다.

최종 결과가 분리 된 미생물의 이름과 각각의 항생제와 함께 도착하면 의사는 치료법을 변경할지 여부를 평가합니다. 이 결정은 그가 받고있는 항생제에 대한 미생물의 감수성과 환자의 진화에 대한 연구에 따라 내려 질 것입니다.

기초

이것은 염색, 매염제로 고정, 변색 및 대조 염색의 4 가지 기본 단계가있는 기술입니다. 따라서이 기술은 박테리아를 착색하는 것 외에도 분화를 허용합니다.

크리스탈 바이올렛이 사용 된 첫 번째 착색제입니다. 그것은 peptidoglycan에 대한 친화력을 가지고 있으며 존재하는 모든 박테리아를 자주색으로 염색 한 후 lugol이 배치되어 매염제 역할을합니다. 즉, 세포 내에서 불용성 크리스탈 바이올렛-요오드 복합체의 형성을 유도합니다. .

두꺼운 펩티도 글리 칸 벽을 가진 그람 양성 박테리아는 더 많은 복합체 (크리스탈 바이올렛-요오드)를 형성하므로 염료를 유지합니다.

또한 그람 양성균의 벽에 더 많은 양의 불포화 산이 포함되어 산화제 (Lugol)에 큰 친 화성을 나타내는 영향을 미칩니다.

한편, 그람 음성 박테리아는 펩티도 글리 칸의 얇은 층을 가지고있어 박테리아가 그람 양성 박테리아보다 덜 복합체를 형성하게합니다.

그런 다음 그람 양성균과 그람 음성균이 다르게 행동하는 변색 단계가 있습니다.

그람 음성 박테리아는 세포벽의 일부인 지질 다당류가 풍부한 외막을 포함합니다. 지방은 아세톤 알코올과의 접촉으로 파괴되어 외막이 불안정 해지고 보라색 결정이 방출됩니다.

이것이 safranin 또는 basic fuchsin으로 대응하여 빨간색으로 변하는 방법입니다.

그람 양성균의 경우 표백제가 모공을 막음으로써 작용하여 크리스탈 바이올렛 / 요오드 복합체가 누출되는 것을 방지하기 때문에 퇴색에 저항합니다.

따라서 크리스탈 바이올렛의 착색은 안정적으로 유지되며 safranin 또는 fuchsin의 여지가 없습니다. 이것이이 박테리아가 진한 파란색이나 보라색으로 얼룩지는 이유입니다.

기재

Gram의 염색 세트는 다음으로 구성됩니다.

• 보라색 유리
• 루골
• 아세톤 알코올
• 사 프라 닌 또는 기본 푹신

염료 및 시약 준비

크리스탈 바이올렛 솔루션

해결 방법 :

바이올렛 크리스탈 ------------- 2 gr

에틸 알코올 95 % ----------- 20cc

솔루션 B :

암모늄 옥살 레이트 ----------- 0.8 gr

증류수 ------------- 80cc

크리스탈 바이올렛의 최종 제조를 위해 용액 A를 증류수로 1:10으로 희석하고 용액 B의 4 부분과 혼합해야합니다. 혼합물은 사용하기 전에 24 시간 동안 저장됩니다. 여과지를 사용하여 황색 염색 병에 걸러냅니다.

매일 사용되는 양은 호박색 점 적기 병으로 옮겨집니다.

Iodo-Lugol

다음과 같이 각 화합물의 표시된 양을 계량하고 측정하십시오.

요오드 결정 ------------- 1gr

요오드화 칼륨 ------------- 2gr

증류수 ------------- 300cc

요오드화 칼륨은 물에 조금씩 녹고 요오드가 첨가됩니다. 용액은 호박색 병으로 면도됩니다.

매일 사용할 양은 점 적기가 달린 작은 호박색 병으로 옮겨집니다.

표백

95 % 에틸 알코올 -----------– 50 ml

아세톤 ------------------ 50 ml

동일한 부분으로 준비됩니다. 증발하는 경향이 있으므로 잘 덮으십시오.

점 적기 병에 넣으십시오.

이 준비는 적당한 시간에 5-10 초에 변색을 제공하며 가장 권장됩니다.

초보자는 95 % 에틸 알코올 만 사용하는 것을 선호하며 페이딩이 10-30 초보다 느립니다.

경험이 많은 사람은 순수한 아세톤을 사용할 수 있지만 1 초에서 5 초 사이에 변색이 매우 빠르게 발생합니다.

대조

Safranin 스톡 솔루션

사 프라 니나 -------------– 2.5 gr

에틸 알코올 95 % --------– 100cc

표시된 양의 사 프라 닌을 칭량 한 후 95 % 에틸 알코올 100ml에 녹인다.

작동 사 프라 닌 용액은 스톡 용액에서 준비됩니다.

이렇게하려면 원액 10cc를 측정하고 증류수 90cc를 추가하여 100ml를 만듭니다.

매일 사용할 양을 점 적기가 달린 호박색 병에 옮기는 것이 좋습니다.

특정 혐기성 ​​세균, Legionella sp, Campylobacter sp 및 Brucella sp와 같이 그람-허커 염색으로 그람 음성을 약하게 염색하는 미생물은 코펠 로프의 그람-허커 염색 변형을 사용하여 훨씬 더 잘 염색 할 수 있습니다. 그람-코펠 로프 염색이라고합니다.

이 기술은 safranin 염료를 기본 fuchsin으로 변경합니다. 이러한 변형으로 전술 한 미생물을 효과적으로 착색 할 수있다.

시약 저장

준비된 착색제는 실온에서 보관해야합니다.

착색 할 샘플의 얼룩 준비

도말에서 미생물을 관찰하기 전에 샘플에 최소 10 ^{5 개의} 미생물이 포함되어 있어야합니다 . 도말은 직접 샘플 또는 고체 또는 액체 배지에서 배양하여 만들 수 있습니다.

존재하는 구조를 더 잘 시각화하려면 얼룩이 균일하고 잘 분포되어 있고 너무 두껍지 않아야합니다.

-직접 샘플 그램

원심 분리되지 않은 소변의 그램

소변을 혼합하고 10 µl를 슬라이드에 놓습니다. 적어도 하나의 박테리아 / Dip 필드를 관찰하면 감염이 있음을 나타냅니다.

이는 배양액의 85 %에서 약 100,000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) 이상의 소변 이 있음을 의미합니다 .

이 방법은 100,000 CFU 미만의 콜로니 카운트에는 유용하지 않습니다.

CSF 그램

CSF를 원심 분리하고 상층 액을 제거하고 펠릿을 슬라이드에 펼칩니다. 이 액체는 정상적인 조건에서 멸균됩니다. 박테리아 관찰은 감염을 나타냅니다.

호흡기 샘플 그램

객담, 기관지 또는 기관지 폐포 세척 그람은 다양한 미생물이있을 수 있지만 관찰 된 세포 유형에 유용 할뿐만 아니라 항상 진단을 안내합니다.

가래의 경우, 검체의 가장 화농성 부분으로 도말을 준비해야합니다.

대변 ​​그램

이 유형의 샘플에는 진단 값이 없으므로 Gram을 수행하지 않는 것이 좋습니다.

-작물 그램

두 가지 방법, 하나는 액체 배양에서, 다른 하나는 고체 배양에서 수행 할 수 있습니다.

액체 배양

액체 배양에서는 매우 간단합니다. 흐린 국물 몇 개 로스트를 버너 아래에 놓고 깨끗하고 건조한 슬라이드에 놓고 중앙에서 주변으로 원을 그리며 재료를 고르게 분포시킵니다.

공기 중에서 자연스럽게 말리십시오. 건조되면 재료가 열로 시트에 고정됩니다. 이를 위해 핀셋의 도움으로 시트를 Bunsen 버너의 불꽃을 통해 3-4 번 통과시켜 재료를 태우지 않도록주의합니다.

시트를 식히고 착색 다리 위에 놓습니다.

단단한 작물

고체 배양에서 그람 염색에 대한 도말을 수행하려면 다음과 같이 진행하십시오.

촬영할 콜로니를 선택하기 전에 슬라이드를 준비하여 멸균 생리 식염수 약 두 방울을 배치해야합니다.

원래 배양 플레이트에 여러 가지 유형의 콜로니가 포함되어있는 경우 각각의 분리 된 콜로니를 선택하여 그람을 수행합니다. 각 콜로니는 이전에 슬라이드에 놓인 식염수에 녹이기 위해 백금 루프와 함께 가져옵니다.

슬라이드에 콜로니를 균일하게 분배하기 위해 중심에서 주변으로 원형 이동이 이루어집니다.

공기 중에서 자연스럽게 말리십시오. 건조되면 이전에 설명한대로 (라이터로 슬라이드를 불 태워) 열로 시트를 고정하고 재료를 태우지 않도록주의합니다.

이 절차는 각기 다른 유형의 식민지로 수행해야합니다. 종이에 관찰되는 순서를 기록해야합니다. 예를 들면 다음과 같습니다.

콜로니 1 : 베타 용혈성 황색 콜로니 : 그람 양성 구균이 군집에서 관찰 됨

콜로니 2 : 크림색 콜로니, 용혈 없음 : 그람 음성 코코 바실러스가 관찰되었습니다.

각 슬라이드에는 우리가 관찰하는 내용을 알 수 있도록 레이블이 지정되어야합니다.

기술

그람 염색 기술은 수행하기가 매우 간단하고 상대적으로 저렴하며 미생물학 실험실에서 놓칠 수 없습니다.

다음과 같이 수행됩니다.

1. 열로 얼룩을 수정하고 염색 다리 위에 놓습니다.
2. 슬라이드를 크리스탈 바이올렛으로 1 분 동안 완전히 덮습니다.
3. 물로 씻어 내십시오 건조하지 마십시오
4. 루골 용액으로 시트를 덮고 1 분 동안 그대로 두십시오. 물로 씻어 내십시오 건조하지 마십시오.
5. 알코올 아세톤에 부드럽게 흔들면서 5-10 초 동안 표백합니다. 또는 시트를 수직 위치에 놓고 남은 보라색 유리가 제거 될 때까지 표면에 탈색제를 떨어 뜨립니다. 초과하지 마십시오.
6. 물로 씻어 내십시오 건조하지 마십시오.
7. 염색 브리지의 슬라이드를 교체하고 safranin (Gram-Hucker)으로 30 초 동안 또는 기본 fuchsin (Gram-Kopeloff)으로 1 분 동안 덮습니다.
8. 물로 씻으십시오
9. 똑바로 세운 상태에서 자연 건조 시키십시오.

건조되면 침지 오일 한 방울을 놓고 광학 현미경의 100X 대물 렌즈 아래에서 관찰합니다.

유용

이 기술은 대부분의 박테리아의 형태 적 차이를 구별 할 수 있습니다.

효모도이 착색으로 구별됩니다. 그들은 크리스탈 바이올렛을 취합니다. 즉, 그램 양성으로 염색됩니다.

한편, 포자를 형성하는 그람 양성 간상체는 포자가 잘 염색되지는 않지만 내생 포자가 형성된 바실러스 내에서 빈 공간이 관찰되는 것을 구별 할 수있다. Shaeffer-Fulton과 같은 다른 기술은 포자를 염색하는 데 사용됩니다.

이 염색은 모든 유형의 박테리아를 착색하는 데 사용되지는 않습니다. 즉, 염색이 작동하지 않는 경우가 있습니다.

이 경우 세포벽이없는 박테리아를 언급 할 수 있습니다. 예 : 마이코 플라스마 속, 스페 로플 라스트, 요소 플라스마, L- 형 및 원형질체.

또한 Mycobacteria와 같은 mycolic acid가 풍부한 벽과 Chlamydias 및 Rickettsias와 같은 세포 내 박테리아로 매우 심하게 박테리아를 염색합니다.

또한 대부분의 스피 로케 탈 박테리아를 염색하는 데 효과가 없습니다.

그람 양성 및 그람 음성과 동일한 샘플에서 관찰 할 수있는 동일한 속의 박테리아가 있습니다. 이런 일이 발생하면 가변 그람 염색이라고하며, 이는 영양소, 온도, pH 또는 전해질 농도의 변화로 인한 것일 수 있습니다.

흔한 실수

과장된 표백

변색 단계에서 과장하면 그람 음성 위조 미생물이 관찰 될 수 있습니다.

침지 오일을 추가하기에 충분한 건조 시간을 기다리지 않음

그람 양성균이 그람 음성 (거짓 그람 음성)을 염색 할 수 있습니다. 이것은 오래된 문화에서 죽거나 부패한 박테리아가있을 가능성이 높고 이러한 조건에서 박테리아가 크리스탈 바이올렛을 유지하지 않기 때문에 발생합니다.

아주 오래된 lugol 솔루션을 사용하십시오.

시간이 지남에 따라 lugol은 속성을 잃고 색상이 사라집니다. 이미 퇴화 된 시약을 사용하면 크리스탈 바이올렛이 잘 고정되지 않으므로 잘못된 그람 음성 미생물을 시각화 할 수 있습니다.

파란색 배경

적절하게 변색 된 배경은 빨간색입니다. 파란색 배경은 변색이 불충분 함을 나타냅니다.

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