면역은 공유 고체 지지체 상에 고정 된 세포 시료의 특정 타겟을 식별하는 형광 분자에 결합하는 항체를 이용한 면역 염색하는 강력한 기술이다.
이 기술은 면역 학적 특이성을 가진 현미경 관찰을 포함하며, 극소량의 항원을 제공 할 수있는 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 관찰 할 수 있습니다. 그것은 연구 분야와 다양한 병리의 임상 진단 모두에서 널리 사용됩니다.
심근 세포에서 액틴 필라멘트의 면역 표지 (출처 : Wikimedia Commons를 통한 Ps1415)
이 기술은 주로 정 성적 (일부 정량적 변형 포함)으로 항체에 결합 된 형광 분자이며 특정 파장에서 여기 될 수있는 형광 단의 생성물 신호에 의한 시료 시각화와 관련이 있습니다. .
세포 맥락에서 단백질의 존재 / 부재 및 세포 하 위치를 연구하는 것은 매우 유용합니다. 이 기술은 처음에는 인플루엔자와 같은 바이러스의 진단을위한 임상 환경에서 사용되었으며 이후에 다른 많은 전염병에도 사용되었습니다.
매우 민감한 기술이며 적절한 현미경 장비를 사용하면 매우 좋은 해상도를 가질 수 있습니다. 관찰을 위해서는 공 초점 또는 에피 플루 오레 선 현미경의 사용이 필요합니다.
그러나 매우 인기가 있음에도 불구하고 일부 배경 "노이즈"를 생성하는 비특이적 형광을 얻는 것과 관련하여 몇 가지 중요한 문제를 제시 할 수 있으며, 이는 종종 결과의 적절한 판독을 제한합니다.
기초
면역 형광은 항체와 항원 사이의 상호 작용 반응의 생물학적 현상을 활용하는 것을 기반으로합니다. 이는 형광 분자를 특정 파장으로 여기시켜이 반응을 시각화하거나 감지하는 것과 관련이 있습니다.
항체는 활성 B 세포에서 분비되는 면역 글로불린 단백질로 항원에 대해 특이 적으로 생성되어 높은 친화 성과 특이성을 가지고 결합 할 수 있습니다. 면역 형광은 혈청에 용해되는 IgG 면역 글로불린을 사용합니다.
항체는 두 개의 짧은 (가벼운) 및 두 개의 긴 "Y"모양 (무거운) 펩타이드 사슬로 구성된 최대 950 kDa의 분자입니다. 경쇄와 중쇄는 둘 다 두 도메인으로 나뉩니다. 하나는 항원을 인식 할 수있는 하나의 변수이고 다른 하나는 각 종의 특징 인 불변하거나 보존 된 것입니다.
항원은 기능적으로 항체가 인식 할 수있는 분자로 정의되며 대부분 단백질입니다. 동물이 항원에 노출되면 면역계의 림프구가 활성화되어 이에 대한 특정 항체를 생성하고 방어 시스템으로 기능합니다.
예를 들어, 단백질과 같은 항원은 하나 이상의 에피토프 또는 항체에 의한 인식 부위를 가질 수 있으므로 항원에 노출 된 동물의 혈청은 동일한 단백질의 다른 영역에 대한 다 클론 항체를 가질 수 있습니다.
면역 형광은 특정 항원에 대한 다 클론 항체를 생산하는 동물의 능력을 이용하여이를 정제 한 후 다른 상황에서 동일한 항원을 검출하는 데 사용합니다.
일부 면역 형광 기술에 가장 많이 사용되는 형광 염료 또는 분자 중에는 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC), 테트라 메틸 로다 민 이소 티오 시아 네이트 -5 및 6 (TRITC), Cy2, Cy3, Cy5 및 Cy7과 같은 많은 시아닌 및 Alexa Fluor®라고하는 염료가 있습니다. , 예를 들어 Alexa Fluor®448.
실험 계획안
면역 형광 프로토콜은 여러 요인에 따라 다르지만 일반적으로 다음과 같이 구성된 단계의 선형 시퀀스를 포함합니다.
- 플레이트 및 세포의 준비
- 샘플 고정
- 투과성
- 블로킹
- 면역 염색 또는 면역 염색
- 조립 및 관찰
-예비
샘플 중
샘플 준비는 수행 할 경험의 성격과 유형에 따라 다릅니다. 현탁 상태에서 세포를 사용하는 가장 간단한 경우는 아래에서 설명합니다.
액체 배양 배지에서 현탁액에있는 세포는 먼저 원심 분리에 의해 세포로부터 분리되어야하며, 그 다음 완전성을 보존하는 완충 용액 또는 동위 원소 "완충액"으로 세척해야합니다.
일반적으로 PBS로 알려진 인산염-식염수 완충액이 사용되며, 여기에서 세포를 재현 탁하고이 혼합물을 다시 원심 분리하여 방해 물질을 포함 할 수있는 배양 배지가없는 세포를 얻습니다.
블레이드
세포가 나중에 해당 다운 스트림 처리를 위해 고정되는 현미경 관찰에 사용되는 슬라이드도 신중하게 준비해야합니다.
이들은 아미노 그룹의 양전하와 세포를 코팅하는 단백질의 음전하.
샘플 고정
이 과정은 공간적 위치를 그대로 유지하기 위해 세포 내부에서 발견되는 단백질을 고정시키는 것으로 구성됩니다. 사용되는 분자는 모든 유형의 세포막을 가로 질러 공유 단백질과 격자를 형성 할 수 있어야합니다.
포름 알데히드와 파라 포름 알데히드, 글루 타르 알데히드, 심지어 메탄올까지 널리 사용되며, 여기에서 세포 샘플을 일정 시간 동안 배양 한 다음 동위 원소 완충 용액으로 세척합니다.
세포를 고정한 후에는 이전에 폴리 리신으로 감작 된 시트에 계속 부착됩니다.
투과성
수행되는 테스트 유형에 따라 연구중인 세포를 투과시킬 수 있는지 여부가 필요합니다. 원하는 것이 세포 표면에있는 특정 단백질의 위치, 존재 또는 부재를 아는 것이라면 투과 화가 필요하지 않을 것입니다.
반면에 세포 내 단백질의 위치를 알고 싶다면 투과성이 필수적이며 세포막을 투과 할 수있는 세제 인 Triton X-100과 함께 샘플을 배양하는 것으로 구성됩니다.
블로킹
모든 면역 학적 기술의 기본 단계는 차단입니다. 절차의이 단계에서 차단은 민감화 된 시트에서 세포가 부착되지 않은 폴리-리신 분자가있는 모든 부위를 덮는 것으로 구성됩니다. 즉, 비특이적 결합을 방지합니다.
일반적으로 PBS 완충액에 소 혈청 알부민 (BSA)이 포함 된 용액이 차단에 사용되며이 용액을 사용하면 배양 시간이 길수록 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 블로킹을 포함한 각 단계 후에 남은 용액을 씻어 내야합니다.
면역 염색 또는 면역 염색
면역 염색 또는 면역 염색 절차는 주로 직접 또는 간접 면역 형광인지에 따라 달라집니다 (아래 참조).
1 차 또는 직접 면역 형광 인 경우 샘플은 원하는 항체와 함께 배양되며, 이는 형광 염료에 결합되어야합니다. 인큐베이션 절차는 BSA를 포함하지만 더 낮은 비율의 용액에서 항체를 희석하는 것으로 구성됩니다.
2 차 또는 간접 면역 형광의 경우 두 번의 연속 배양을 수행해야합니다. 먼저 원하는 항체를 사용한 다음 1 차 면역 글로불린의 불변 영역을 검출 할 수있는 항체를 사용합니다. 형광 단에 공유 결합되는 것은이 2 차 항체입니다.
이 기술은 매우 다재다능하여 직접 면역 형광의 경우 다른 형광 단에 연결된 1 차 항체가있는 한 샘플 당 하나 이상의 항원을 동시에 라벨링 할 수 있습니다.
간접 면역 형광의 동시 라벨링을 위해서는 각 1 차 항체가 다른 동물에서 생산되고 각 2 차 항체가 다른 형광 단에 결합되어 있는지 확인해야합니다.
차단과 마찬가지로 항체와 함께 배양하면 시간이 길수록 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 각 단계 후에는 샘플에 결합하지 않은 과잉 항체를 씻어 내야하며, 2 차 면역 형광에서는 2 차 항체를 추가하기 전에 차단해야합니다.
특정 기술은 DAPI 형광 단을 사용한 핵 DNA 염색과 같이 면역 염색과 관련이없는 다른 염색을 사용합니다.
조립 및 관찰
형광 단과 함께 최종 배양 시간 동안 샘플은 어둠 속에 남아 있어야합니다. 현미경 관찰을 위해 항체에 결합 된 형광체의 형광을 보존하기 위해 일부 물질을 사용하는 것이 일반적입니다.
종류
직접 및 간접 면역 형광의 그래픽 요약 (출처 : Wikimedia Commons를 통한 Westhayl618)
직접 또는 1 차 면역 형광
그것은 형광 항체를 사용하여 항원을 검출하는 것과 관련이 있습니다. 이 기술을 사용하는 주요 이점은 속도이지만, 특히 이질적인 항체가 풍부하기 때문에 인간 혈청을 연구 할 때 프로세스에서 많은 경우의 비특이적 결합이 발생할 수 있습니다.
간접 또는 이차 면역 형광
"샌드위치"기술이라고도하며 이는 두 단계의 기술 개발을 포함합니다. 첫 번째는 비 형광 항체의 사용과 관심 항원에 대한 결합과 관련이 있습니다.
이 첫 번째 항체의 불변 영역 (이제 항원으로 작용할 것임)에 대해이를 인식 할 수있는 두 번째 항체가 사용되며, 이는 형광 분자와 결합됩니다.
형광 신호의 출현은 첫 번째 비 형광 항체와 관심 항원 사이의 특이적인 인식의 결과입니다. 이 첫 번째 항체의 존재는 두 번째 항체의 상태를 나타내며, 이는 표지되고 그 덕분에 항원의 존재 또는 부재가 결정될 수 있습니다.
직접 면역 형광법보다 훨씬 더 많은 시간이 소요되는 기술 임에도 불구하고 (하나 이상의 배양 단계를 포함하므로)이 기술은 연구되는 각 항원에 대한 형광 항체 설계를 포함하지 않으므로 경제적 측면에서, 더 실행 가능합니다.
또한 하나 이상의 이차 항체가 일차 항체의 불변 영역에 결합하여 형광 신호의 강도를 증폭시킬 수 있기 때문에 신호 증폭 측면에서 더 민감한 기술입니다.
응용
이전에 언급했듯이 면역 형광은 매우 다재다능한 기술로 과학 및 임상 분야에서 다양한 방식으로 사용되었습니다. 많은 유기체에 관한 생태 학적, 유전 적, 생리 학적 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.
임상 적용 중에는 연구 대상 환자의 상피 조직에 직접 또는 간접 면역 형광을 사용하여 일부 피부과 질환의 직접 진단에 사용됩니다.
면역 형광 기술은 효모와 같은 단세포 유기체에서 핵내 및 세포질 미 세관, 액틴 및 관련 단백질, 10nm 필라멘트 및 세포질, 막 및 세포벽의 기타 구성 요소를 시각화 할 수 있습니다.
참고 문헌
- Abcam, 면역 세포 화학 및 면역 형광 프로토콜. abcam.com에서 검색
- Greph, C. (2012). 형광 염료. leica-microsystems.com에서 검색 함
- Miller, DM 및 Shakest, DC (1995). 면역 형광 현미경. In Methods in Cell Biology (Vol. 48, pp. 365–394). Academic Press, Inc.
- Odell, ID, & Cook, D. (2013). 면역 형광 기법. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
- Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG 및 Brian, K. (1991). 효모에 대한 면역 형광법. 효소 학의 방법 (Vol. 194, pp. 565–602). Academic Press, Inc.
- Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). 공중 보건 바이러스학에서 면역 형광의 응용. 세균 학적 검토, 28 (4), 402–408.
- Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). 식물성 플랑크톤 연구에서의 면역 형광 : 응용 및 잠재력. J : Phycol. , 32, 1–16.