Löwenstein-젠슨 매체 배양하지 않은 테 리움 래 프리의 종 예외와 같은 중에서도 결핵균, M. 테륨 아 비움, 같은 마이 코박 테 리움 속의 세균의 분리 및 개발 선택적 고체 배지이다.
마이 코박 테 리움 속의 세균은 기존의 배양 배지에서 자라지 않기 때문에 분리를위한 특수 배지를 설계 할 필요가있었습니다. 원래 매체는 Löwenstein이 만들고 나중에 Jensen이 수정했습니다.
Mycobacterium tuberculosis의 콜로니가있는 Löwenstein-Jensen 배지. 출처 : Agarwal et al / BioMed Central Ltd., Biology Image Library 제공
수정은 콩고 적색 염료를 제거하여 더 높은 농도의 말라카이트 그린으로 대체하는 것으로 구성되었습니다. 또한 구연산 마그네슘과 인산 일 칼륨의 농도를 변경했습니다.
Löwenstein-Jensen 배지에는 현재 감자 전분, 아스파라긴, 구연산 마그네슘, 인산 일 칼륨, 황산 마그네슘, 말라카이트 그린, 날 리딕 산, 사이클로 헥시 미드, 링코 마이신, 구타 계란, 글리세린 및 물이 포함되어 있습니다.
마이코 박테리아는 일반적으로 객담, 소변, 농양 등과 같이 멸균되지 않은 부위에서 분리됩니다. 즉, 대부분의 샘플에는 해당 지역의 일반적인 미생물 군과 병원체가 포함됩니다.
이것이 Löwenstein-Jensen 배지가 말라카이트 그린, 항생제 및 항진균제로 대표되는 일련의 억제제를 포함하는 이유입니다.
또한 비 멸균 부위에서 얻은 샘플은 Löwenstein-Jensen 배지에 시드하기 전에 오염을 제거하고 중화해야합니다.
기초
Löwenstein-Jensen 배지에있는 계란과 글리세린은 이러한 미생물의 발달에 필요한 지방산과 단백질을 제공하기 때문에 미코 박테리아의 성장을 촉진합니다.
Löwenstein-Jensen 배지에는 수반되는 미생물 군의 억제제 인 말라카이트 그린이 포함되어 있습니다. 그러나 그람 음성 미생물 총을 억제하는 날 리딕 산 (35 µg / mL), 부양 균과 효모를 억제하는 시클로 헥시 미드 (400 µg / mL), 그람 양성 미생물 총을 억제하는 린코 마이신 (2 µg / mL)도 포함되어 있습니다.
일부 상업용 주택은 polymyxin B 200,000 units / L, amphotericin B 10mg / L, carbenicillin 50mg / L 및 trimethoprim 10mg / L과 같은 항생제 조합을 추가하는 것을 선호합니다.
이 배지에는 한천이 포함되어 있지 않으므로 멸균 과정에서 알에 존재하는 알부민의 응고로 인해 배지의 응고가 발생합니다.
예비
12ml의 글리세롤을 미리 첨가 한 600ml의 증류수에 탈수 된 배지 37.3g을 칭량한다. 혼합물을 가열하고 완전히 용해 될 때까지 자주 저어줍니다. 배지를 121 ° C에서 15 분 동안 오토 클레이브합니다.
다른 한편, 1000ml의 신선한 계란의 균일 한 현탁액은 무균 조건에서 준비되어야합니다. 50-60 ° C의 온도에서 준비된 600 ml의 배지에 계란 현탁액을 추가하여 기포를 피하십시오.
오토 클레이브에서 살균 한 후 항생제 용액도 추가됩니다.
배지를 멸균 나사 캡 테스트 튜브에 붓습니다. 기울어 진 위치에서 튜브를 85 ° C에서 45 분 동안 가열합니다.
준비된 배지의 색상은 청록색이며 계란 지질의 존재로 인해 흰색 반점이 나타날 수 있습니다.
매체의 pH는 7.2 ± 0.2 여야합니다.
튜브를 냉장고에 보관하고 사용할 때까지 직사광선으로부터 보호하십시오. 파종하기 전에 성질을 낸다.
"Löwenstein Jensen의 Gruft 수정"이라는 매체의 수정이 있습니다. 여기에는 기존 배지와 동일한 화합물이 포함되어 있지만 RNA-5mg / 100mL가 추가되고 억제제로 말라카이트 그린 0.025g / 100mL, 페니실린 50U / mL 및 날 리딕 산 35ug / mL가 포함되어 있습니다.
응용
Löwenstein-Jensen 배지는 다양한 유형의 샘플에서 마이코 박테리아를 분리하는 데 사용됩니다. Ziehl-Neelsen 염색은 마이코 박테리아의 존재가 의심되는 모든 검체에 권장됩니다.
일부 샘플은 멸균 부위에서 나오지만 다른 샘플은 그렇지 않습니다. 비 멸균 샘플은 적절하게 오염을 제거해야합니다.
담
객담 샘플은 다음과 같이 오염을 제거해야합니다 : 객담 샘플의 양을 ml 단위로 결정하고 동일한 양의 4 % NaOH를 샘플에 추가하고 37 ° C에서 배양합니다.
30 분 이내에 자주 흔든다. 그 후 3000RPM에서 30 분 동안 원심 분리합니다.
페놀 소독제 위에 뜨는을 폐기하십시오. 파종을 위해 침전물을 사용하지만 먼저 pH를 중화해야합니다.
침전물을 중화하기 위해 페놀 레드 지시약이있는 상태에서 연 어색을 유발하는 중성 pH에 도달 할 때까지 5 % H 2 SO 4 를 사용 합니다.
위 세척, 기관지 세척 및 기관지 흡인
이 경우 샘플은 30 분 동안 3000RPM에서 원심 분리되어야합니다. 상층 액을 버리고 펠릿을 사용합니다. 침전물을 오염 제거하려면 4 % NaOH 3ml를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 자주 저어줍니다.
다시 원심 분리하여 상층 액을 버리고 펠릿을 사용합니다. 후자는 가래 샘플에 설명 된대로 중화되어야합니다.
오줌
샘플을 냉장고에 24 시간 동안 담그십시오. 뜨는을 분리합니다. 나머지 펠렛은 3000 RMP에서 30 분 동안 원심 분리해야합니다. 다시 뜨는을 버리고 멸균 생리 용액 3ml로 펠렛을 재구성합니다.
4 % NaOH 3ml를 추가하고 앞서 설명한대로 오염 제거 및 중화를 진행합니다.
복수 액, 흉막액, 뇌척수액
이 유형의 샘플에서는 원심 분리되고 상층 액은 폐기됩니다. 침전물에 그람을 수행하거나 현미경으로 직접 관찰하십시오. 박테리아가 관찰되지 않으면 오염 제거 단계가 필요하지 않으며 중화 단계도 필요하지 않습니다.
이 경우 침전물을 사용하여 샘플을 직접 파종 할 수 있습니다. 박테리아가있는 경우 위에서 설명한대로 오염 제거 및 중화를 진행하십시오.
생검
이 유형의 샘플에 증류수 5ml를 추가하여 나중에 10 분 동안 1500RPM에서 원심 분리해야합니다. 상층 액을 버리고 펠릿을 3500RPM에서 30 분 동안 다시 원심 분리합니다. 침전물을 사용하여 배양 배지를 뿌립니다.
후두 면봉
면봉은 동일한 비율의 증류수와 4 % NaOH가 들어있는 멸균 튜브에 넣어야합니다. 샘플이 액체에 희석되도록 면봉을 튜브 벽에 대고 눌러야합니다. 원심 분리하고 침전물을 사용합니다. 이미 설명한대로 침전물을 중화합니다.
뿌리다
Löwenstein-Jensen 배지는 배지 표면에 샘플 0.5ml를 첨가하여 접종합니다. 튜브를 회전하여 매체 전체에 샘플을 배포합니다. 백금 손잡이를 사용하지 마십시오.
Stonebrink 배지를 포함하는 두 번째 튜브는 Mycobacterium bovis 및 Löwenstein-Jensen 배지에서 자라지 않는 기타 종을 분리하기 위해 시드 할 수 있습니다.
잠복
접종 된 튜브는 37 ° C에서 호기성으로 배양되며 뚜껑이 약간 느슨하고 약 5 °로 기울어 져 빛으로부터 보호됩니다. 환경은 5 ~ 10 %의 이산화탄소로 풍부해질 수 있습니다. 식민지가 나타날 때까지 일주일에 두 번 문화를 확인하십시오.
샘플이 흡수되면 캡이 조여집니다. 최대 배양 시간은 8 주이며,이 시간 이후에 성장이 없으면 음성으로보고됩니다.
QA
다음 균주를 품질 관리로 사용할 수 있습니다.
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615 320, Cryptococcus 320of19615의 Cryptococcus 320of
M. fortuitum의 성장은 좋을 것이지만 M. bovis의 경우 성장이 거의 또는 전혀 예상되지 않기 때문에 언급 된 처음 세 종의 우수한 발전이 예상됩니다. 한편, Mycobacterium 속 이외의 종은 완전히 억제되어야합니다.
한계
준비된 매체는 빛으로부터 보호되어야합니다. 빛에 장기간 노출되면 매체가 녹색에서 파란색으로 변합니다.이 경우 매체를 더 이상 사용할 수 없습니다. 말라카이트 그린은 감광성이 있기 때문입니다.
계란이 포함 된 배지는 무균 처리하지 않으면 쉽게 오염 될 수 있습니다. 단백질 분해 박테리아로 오염되면 용해 될 수 있습니다.
Mycobacterium 속의 박테리아를 배양하고 조작하려면 오염되거나 다른 사람을 오염시키는 것을 방지하기 위해 따라야하는 생물 보안 조치를 알고있는 자격을 갖춘 인력이 필요합니다.
HCl은 염화나트륨의 형성으로 인해 중화 단계에서 사용되어서는 안되며, 이는 Koch의 세균에 유독 할 수 있습니다.
샘플은 처리되지 않는 동안 냉장 보관하고 빛으로부터 보호해야합니다.
참고
- Francisco Soria Melguizo 연구소. 2009. Löwenstein-Jensen 선택적 배지. 사용 가능 : f-soria.es
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- "Löwenstein-Jensen 매체." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 2018 년 11 월 20 일 15:15 UTC 2019 년 4 월 24 일, 18:34. wikipedia.org
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