K 티나는 즉 세린 프로테아제의 그룹에 속하는 효소이며, 그것의 중간 촉매 활성 아미노산 세린에 갖고 가수 분해하여 펩티드 결합을 차단하는 기능을 갖는다. 차례로,이 효소는 서브 틸리 신 단백질 (펩 티다 제 S8) 계열에 속합니다.
Proteinase K의 분자량 (MW)은 28,900 달톤이며 이전에 Tritirachium 앨범 Limber로 알려진 곰팡이 Engyodontium 앨범의 추출물에서 1974 년에 처음으로 분리되었습니다.
Proteinase K의 분자 구조. 출처 : Lykchiniadis
그것은 모발에 존재하는 각질을 분해 할 수있는 것으로 입증 된 높은 단백질 분해 능력을 가지고 있습니다. 영어에서 케라틴이라는 단어의 철자는 "케라틴"이므로 "단백 분해 효소 K"라고 불립니다.
천연 단백질을 절단하는 높은 힘으로 인해이 효소는 다양한 분자 생물학 기술에 유용합니다. 주로 고 분자량 (MW) 핵산을 분리하고 준비하는 데 사용됩니다.
Proteinase K는 핵 DNA를 방출하면서 단백질을 파괴하고 RNase 및 DNase를 비활성화합니다. 즉, DNA 및 RNA 준비에서 뉴 클레아 제를 제거합니다.
한편, 프로 테이 나아 제 K는 일부 변성 된 천연 단백질을 가수 분해 할 수 있다는 사실이 밝혀져 프리온 단백질 (PrPC) 연구에 사용하는 연구자들의 관심을 불러 일으켰습니다.
그러나 단백질 분해능이 높음에도 불구하고 프로 테이 나아 제 K의 작용에 저항하는 단백질이 있습니다. 그중에는 전염성 해면상 뇌병증과 관련된 프리온 (PrPSc)이라고하는 비정상 단백질이 있습니다.
Proteinase K 특성
Proteinase K는 3 개의 층으로 구성된 3 차 구조를 가지고 있으며, 2 개의 나선 층 사이에 7 체인 β 시트가 삽입되어 있습니다. S8 계열의 펩 티다 제에 속하기 때문에 활성 부위에 촉매 삼합 체가 있으며, 순차 순서는 (Asp, His 및 Ser)이며, 이는 다른 계열의 펩 티다 제와 구별됩니다.
세린 프로테아제 그룹의이 효소는 지방족 및 방향족 아미노산의 카르 복실 산 그룹에 가까운 펩티드 결합을 가수 분해하는 것이 특징입니다.
반면에 SDS (sodium dodecyl sulfate), Tris-HCL 및 EDTA와 같은 특정 부식성 물질의 존재 하에서 작용할 수 있습니다. 이는 단백질의 변성을 돕는 데 사용되어 기본 구조를 잃게합니다.
이것은 전기 영동 기술을 위해 단백질을 준비하는 예비 단계입니다. proteinase K가 작용하는 pH 범위는 상당히 넓으며 (2.0 ~ 12.0), 최적 pH는 7.5 ~ 12.0이며 등전점은 8.9입니다. 보시다시피 매우 넓은 pH 범위에 대해 활성입니다.
proteinase K에서 두드러지는 또 다른 특징은 고온 (50-60 ° C)에서의 안정성입니다.
효소 활성
Proteinase K는 칼슘 이온의 존재를 필요로하지만 안정성을 유지하는 데 필수적인 경우 활성에는 영향을 미치지 않습니다.
단백질 분해 효소 K가 기질을 완전히 소화하려면 약 5 분에서 2 시간의 접촉 시간이 필요합니다.
그러나 이러한 의미에서 Daza et al.은 proteinase K에 대한 다양한 노출 시간에서 얻은 DNA의 순도를 비교하여 장기간 배양 (최대 24 시간)하면 DNA의 품질이 크게 향상된다는 결론을 내 렸습니다.
그러나 서로 다른 프로토콜에서 사용되는 proteinase K 효소의 농도와 관련하여 매우 다양하다고 할 수 있습니다.
매우 낮은 농도 (5 µg / ml)부터 500 µg / ml 농도까지 사용할 수 있습니다. 그러나 가장 일반적인 작업 농도 범위는 50-100μg / ml이며, 특히 단백질 분해 및 뉴 클레아 제 비활성화에 사용됩니다. 조직 치료를 위해서는 2mg / ml의 농도가 필요합니다.
응용
응용 프로그램은 매우 광범위하며 다음과 같이 요약 할 수 있습니다.
-염분, PK-SDS, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB), 변형 아세트산 칼륨, 요오드화 나트륨 추출 등 다양한 방법으로 단백질 분해 및 DNA 추출에 사용됩니다.
-뉴 클레아 제 (RNase 및 DNase)의 비활성화.
-원치 않는 단백질을 제거하는 것 외에도 핵산의 방출을 돕기위한 현장 하이브리드 화 기술 (HIS).
-단백질의 변형.
-연구 수준에서, 다양한 연구에서.
Proteinase K의 장점
Proteinase K를 사용하는 DNA 추출 기술과이를 사용하지 않는 다른 기술간에 여러 비교 연구가 수행되었으며 모두 효소를 사용할 때 더 큰 이점이 있다는 결론을 내 렸습니다. 장점은 다음과 같습니다.
-고 분자량, 고품질, 순도의 DNA 획득
-추출 된 DNA는 최대 3 개월간 안정적입니다.
추출 된 DNA는 서던 블롯, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR), 전기 영동 등의 기술에 사용할 수 있습니다.
Proteinase K 내성 단백질
다양한 조사에서 프리온 (비정상 독성 PrPSc 단백질)은 프로 테이 나아 제 K의 작용에 내성이 있다는 점에서 PrPC (네이티브) 단백질과 다르지만 PrPC는 그 작용에 민감하다는 결론을 내 렸습니다.
다른 저자들은 PrPSc의 구조에 민감한 부분이 있고 다른 부분은 proteinase K에 내성이 있다고 설명했습니다. 그러나 두 부분 모두 독성이 있고 감염성이 있습니다.
반면에 Bastian 등은 1987 년 Spiroplasma mirum 종에서 28, 30, 66 및 76 kda의 4 개의 단백질을 분리했습니다. 모두 proteinase K의 작용에 내성이 있고 일부 프리온과 교차 반응을 보이는 것으로 밝혀졌습니다.
이 종은 백내장과 심각한 신경 학적 손상을 일으킬 수있는 것으로 알려져 있으며 Bastian의 과학적 발견으로 인해 다른 연구 중에서도이 미생물을 전염성 해면상 뇌병증과 연결하려는 시도가 이루어졌습니다.
그러나 이러한 퇴행성 신경 병리학의 원인은 오늘날에도 계속해서 프리온에 기인합니다.
이러한 의미에서 Butler et al.은 1991 년 Mycoplasma hyorhinis의 두 균주에서 40kda의 proteinase K에 저항하는 단백질 부류를 확인하고 특성화했습니다. 이 병원체는 돼지에게 영향을 주어 조직을 감염 시키지만이 경우 테스트 된 프리온과 교차 반응이 없었습니다.
이와 관련하여 많은 알려지지 않은 사항을 밝히려면 더 많은 연구가 필요합니다.
참고 문헌
- Bastian F, Jennings R 및 Gardner W. 1987. 스크래피 관련 섬유소 단백질에 대한 항혈청은 Spiroplasma miru m 섬유소 단백질과 교차 반응합니다. J. Clin. 미생물. 25 : 2430-2431.
- Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. 미확인 시체의 포름 알데히드 고정 근육 조직에서 DNA 추출 및 정제 방법 평가. Med Magazine, 2014 년; 22 (1) : 42-49,
- Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E 및 Mcgarrity G. Mollicutes 클래스 구성원에서 Proteinase K 내성 단백질의 식별 및 특성화. 감염 및 면역, 1991, 59 (3) : 1037-1042
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