산화 효소 테스트 : 이론적 근거, 절차 및 사용 - 생물학 - 2025

옥시다아제 테스트 진단 방법 인 것을 알 효소 복합체라는 사이토 크롬 옥시 다제 (C)의 존재. 이 시스템은 산소를 포획 하고 호흡 사슬 의 마지막 전자 수용체 (H ⁺ ) 역할을하기 때문에 산화로 환원 된 사이토 크롬의 변형을 유도합니다 .

옥시다아제라는 용어는 인도 페놀 옥시다아제라고도 알려진 효소 사이토 크롬 옥시다아제를 나타내는 약칭입니다. 고대에는 효소 인 사이토 크롬 산화 효소와 인도 페놀 산화 효소가 서로 다른 두 가지 효소로 여겨졌지만 오늘날에는 동일한 것으로 알려져 있습니다.

양성 및 음성 산화 효소 검사. 출처 : 기계 판독 가능 작성자가 제공되지 않았습니다. Alpha.prim ~ commonswiki 가정 (저작권 주장에 따라).

시토크롬은 철분을 함유하고 시토크롬 산화 효소 시스템을 완성하는 혈 단백질입니다. 사이토 크롬은 종마다 다를 수 있습니다.

다양한 종류의 사이토 크롬 (사이토 크롬 a1, a2, a3 및 0)이 있습니다. 일부 박테리아는 한 번에 하나만 생성 할 수 있지만 다른 박테리아는 한 번에 최대 2 ~ 3 개를 생성 할 수 있습니다. 이러한 의미에서 사이토 크롬 a와 a3의 존재는 사이토 크롬 산화 효소 c로 알려져 있습니다. 이것은 산화 효소 검사가 감지하는 사이토 크롬의 유형입니다.

Neisseria 속과 Pseudomonas 속에는 사이토 크롬 산화 효소 c가 들어 있습니다. 이 속은 양성 산화 효소 검사를 제공하여 각각 Acinetobacter 및 Stenotrophomonas 속과 구별되도록 도와줍니다.

산화 효소 양성인 다른 속도 있습니다.

기초

Cytochrome oxidase C 시스템의 특성

사이토 크롬 산화 효소 c ​​시스템은 다음과 같은 방식으로 작동합니다. 산화 효소 양성 미생물은 산소를 사용하여 호기성 호흡을 통해 에너지를 생성합니다. 이 시스템은 NADH ⁺ 와 같은 공여체 물질 에서 수용체 물질 (이 경우 산소) 로의 전자 이동 덕분에 작동합니다 .

그 결과 미생물이 보유하고있는 사이토 크롬 산화 효소 시스템에 따라 에너지 (ATP)와 물 또는 과산화수소가 생성됩니다.

이것이 대부분의 옥시 다제 양성 박테리아가 생성 된 과산화수소를 제거하는 데 필요한 조건 인 카탈라제 양성인 이유입니다.이 물질은 박테리아에 독성이 있기 때문입니다.

사이토 크롬 산화 효소 c ​​시스템은 일부 호기성 박테리아, 일부 통성 혐기성 세균, 극소 호기성 세균, 엄격한 혐기성 세균에 존재하지 않습니다. 엄격한 혐기성 세균은 산소가있는 상태에서 살 수 없기 때문에 후자는 이해할 수 있습니다. 따라서 그들은 사이토 크롬 산화 효소 시스템이 부족합니다.

테스트 원리

이 테스트에서는 인공 전자 수용체 역할을하는 물질을 사용하여 전자 수송 사슬 내에서 자연 물질을 대체합니다.

주로 파라 페닐 렌 디아민 및 인도 페놀과 같은 염료가 사용되며 수용체 기질 및 인공 전자 공여체 역할을합니다.

Paraphenylenediamine은 cytochrome oxidase c 시스템에 의해 산화됩니다. 환원 된 형태의 염료는 무색이지만 산화 된 형태에서는 착색됩니다.

이것이 사이토 크롬 산화 효소 c ​​시스템의 존재가 증명되는 방법입니다. 양성 반응은 사용되는 시약에 따라 라벤더 또는 청자색을 생성하기 때문입니다.

반면에 호흡 사슬의 마지막 전자 수용 물질이 산소와 다르면 산화 효소 테스트는 음성이됩니다 (색상 생성 없음). 이것은 혐기성 미생물의 경우입니다.

마찬가지로, 미생물이 사용하는 시토크롬이 시토크롬 옥시 다제 c와 다른 경우에도 음성 검사가됩니다.

방법

산화 효소 테스트를위한 다양한 시약과 프로토콜이 모두 동일한 목적으로 사용됩니다.

시약

Kovacs 시약, Gordon 및 McLeod 시약, Nadi 시약, Carpenter, Suhrland 및 Morrison 시약, 산화 효소 디스크 사용.

-Kovacs oxidase 시약

그것은 1 % tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride로 구성되어 있습니다.

Kovacs의 시약은 50ml의 증류수에 위에서 언급 한 물질 1g을 용해하여 제조됩니다. 완전히 녹을 때까지 미묘하게 가열합니다. 충분한 용량의 호박색 병에 옮기고 증류수로 부피를 100ml로 만듭니다. 사용하기 전에 15 분 이상 기다리십시오. 빛으로부터 보호되는 냉장고에 보관하십시오.

인돌 테스트를 표시하는 데 사용되는 Kovacs 시약과 구별하기 위해 Kovacs oxidase 시약으로 표시되어 있습니다. 이 시약은 가장 민감하고 독성이 적지 만 나머지 시약보다 더 비쌉니다.

이 시약을 사용하면 콜로니 색상이 라벤더로 바뀌고 빠르게 보라색에 가까운 검은 색으로 변하는 긍정적 인 반응이 입증됩니다. 집락에 색 변화가 없거나 약간 분홍빛을 띠기 때문에 부정적인 반응이 분명합니다. 매체도 어두워 질 수 있지만 긍정적 인 반응을 의미하지는 않습니다.

이 시약을 사용하면 반응 시간이 중요하며 5 ~ 15 초 사이에 발생하는 색 변화는 양성 반응으로 간주됩니다.

-Gordon 및 McLeod 시약

N- 디메틸 -p- 페닐 렌 디아민 또는 p- 아미노 디메틸 아닐린 모노 히드로 클로라이드라고도 알려진 디메틸 -p- 페닐 렌 디아민 디 히드로 클로라이드로 구성됩니다. 관련 물질을 대체하여 Kovacs oxidase 시약에 대해 설명 된대로 제조됩니다.

이 시약은 p-phenylenediamine을 포함하는 모든 시약이 불안정하지만 Kovacs oxidase 시약보다 약간 더 안정적입니다.

이 반응은 나중에 10 ~ 30 분 안에 청자색으로 나타나 양성으로 해석된다.

-Nadi 시약

에틸 알코올 (95 % 에탄올)에 1 % α-naphthol과 1 % aminodimethylaniline으로 구성되어 있습니다. 혼합물은 100ml를위한 충분한 양이 될 때까지 희석제로 절대 에틸 알코올을 사용하여 동일한 부분으로 준비됩니다.

-Carpenter, Suhrland 및 Morrison 시약

1 % p-aminodimethylalanine oxalate로 구성되어 있습니다. Kovacs oxidase 시약에 대해 설명한 것과 동일한 방법으로 해당 물질을 변경하여 준비합니다.

용액이 준비된 상태에서 테스트 스트립은 다음과 같이 준비됩니다. 6-8 cm Whatman No. 1 여과지 스트립에 1 % 디메틸 -p- 페닐 렌 디아민 옥살 레이트 시약을 함침시킵니다.

그들은 금속과 접촉하지 않고 건조시키고 건조제와 함께 나사 뚜껑이 달린 항아리에 보관하고 냉장고에 보관할 수 있습니다. 이 스트립은 최대 6 개월 동안 안정적입니다.

언급 된 모든 시약 중 가장 안정적인 시약이며 용액에서 최대 6 개월까지 지속될 수 있습니다. 또 다른 장점은 접시에 직접 사용하는 경우 식민지 주변의 매체에 색을 입히지 않는다는 것입니다.

붉은 색의 출현은 양성 테스트로 해석됩니다.

-Oxidase 디스크

산화 효소 테스트 용 시약이 함침 된 상업용 디스크입니다. 시장에 몇 가지 상업용 브랜드가 있습니다.

신선한 시약을 준비 할 필요가 없으므로 작업이 더 쉬워지기 때문에 사용이 매우 실용적입니다. 얻은 결과는 디스크가 적절하게 보존되는 한 신뢰할 수 있습니다.

프로토콜

다이렉트 플레이트 방식, 종이 위의 간접 방식, 옥시 다제 시약이 함침 된 디스크 사용.

-직접 보드 방식

이러한 목적을 위해 포도당을 포함하지 않는 배양 배지 플레이트에 포함 된 콜로니 (들)에 직접 앞서 언급 한 시약 중 2 또는 3 방울을 첨가합니다.

식민지의 색 변화 여부는 매체가 아니라 해석됩니다. 유효한 반응 시간은 사용 된 시약에 따라 다릅니다.

-종이에 간접적 인 방법

여과지 (Whatman No. 1)를 6cm ² 크기로 자르고 빈 페트리 접시에 넣습니다.

종이에 Kovacs oxidase 시약을 2 ~ 3 방울 떨어 뜨리고 백금 손잡이 나 나무 이쑤시개로 연구 할 집락의 일부를 취하고 시약 함침 지에 일직선으로 펼칩니다. 5 ~ 10 초 이내에 해석합니다.

Carpenter, Suhrland 및 Morrison 시약으로 준비된 스트립을 사용하여 건조 스트립에 식민지를 펼칩니다. 단일 스트립은 여러 균주를 테스트하는 데 사용됩니다. 10 초 안에 해석합니다.

-디스크 (m

상업용 디스크를 멸균 증류수로 미묘하게 적시고 연구 할 콜로니 위에 겹쳐 놓습니다. 35 ° C에서 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 실온의 플레이트 또는 냉장 플레이트를 사용하는 경우 반응이 약간 느립니다. 10 ~ 20 초 사이의 색상 변화를 해석합니다.

혈액 또는 초콜릿 한천에 포함 된 콜로니를 사용할 수 있습니다.

-디스크 (간접 방법)

앞에서 설명한대로 디스크를 적 십니다. 빈 페트리 접시에 넣으십시오. 백금 손잡이 또는 나무 이쑤시개로 연구하기에 충분한 양의 식민지를 취하고 디스크에 놓습니다. 10 ~ 20 초 사이의 색상 변화를 해석합니다.

사용하다

Neisseria와 Acinetobacter 속은 Acinetobacter 속이 그람-음성 간체 임에도 불구하고 때때로 coccoid 형태를 취하고 쌍으로 분포하여 Neisseria 속을 모방하기 때문에 때때로 형태 학적으로 매우 유사합니다.

이 경우 산화 효소 테스트가 정말 유용합니다. Neisseria 속은 양성이고 Acinetobacter 음성입니다.

그러나 Moraxella 속은 Neisseria 속과 매우 유사하며 둘 다 긍정적 인 반응을 보입니다. 이것이 확실한 식별을 위해 탄수화물 발효 테스트를 항상 수행해야하는 이유입니다.

한편, 옥시다아제 검사는 장내 세균과 (모두 옥시다아제 음성)에 속하는 세균을 파스 퇴 렐라, 에어로 모나스, 플레시 오모 나스 (옥시다아제 양성) 속과 같은 다른 발효조와 구별하는데 유용합니다.

Vibrio와 Helicobacter 속도 oxidase 양성입니다.

QA

알려진 대장균 균주를 음성 대조군으로 사용하고 녹농균 균주를 양성 대조군으로 사용합니다.

한계

-시약은 신선하게 준비하여 사용하여야하며, 매우 불안정하여 상온 용액의 유통 기한이 짧습니다. 냉장 보관하면 5 일에서 2 주까지 지속될 수 있습니다.

-시약은 무색이므로 색이 변하면 폐기해야합니다. 시간이 지남에 따라 어두워지기 때문에 손상된 디스크가 나타납니다.

-15-60 초 사이에 Kovacs oxidase 시약과의 양성 반응은 지연된 반응으로 간주되며 60 초 후에는 음성으로 간주되어야합니다.

-Haemophylus influenzae는 dimethyl-p-phenylenediamine이 포함 된 시약을 사용하면 음성 oxidase 반응을 보이지만 Kovacs oxidase 시약 (tetramethyl-p-phenylenediamine)을 사용하면 양성 반응을 보입니다.

-포도당을 함유 한 배지는 검사를 방해하여 위음성을 나타냅니다.

-Bordetella pertussis 균주는 고농축 혈액 한천 플레이트에서 나온 경우 위양성 반응을 일으킬 수 있습니다.

-금속 (철) 손잡이를 사용하면 위양성 반응이 나타납니다.

추천

-시약이 매우 불안정하고 자기 산화되는 경향이 있으므로 1 ~ 2ml의 분취 량을 동결하고 필요에 따라 제거하는 것이 좋습니다.

-시약의 자동 산화를 지연시키는 또 다른 방법은 시약 준비시 0.1 % 아스코르브 산을 첨가하는 것입니다.

-시약이 불안정하므로 매주 품질 관리를 권장합니다.

-품질 관리 테스트를 통과하지 못한 시약은 사용하지 마십시오.

참고 문헌

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