DNA 시퀀싱 : MAXAM-GILBERT, 방법 및 예 - 생물학 - 2026

DNA 시퀀싱 (디옥시리보 핵산)를 할 수 있습니다 분자 생물학 실험실의 절차 에 관심있는 유전 물질의 염기의 순서를 알고있다. 더욱이, RNA (리보 핵산)의 시퀀싱도 개시 될 수있다.

이 기술은 생물학의 발전에 없어서는 안될 기술입니다. 예를 들어 의료 진단 및 법의학 조사와 같은 다른 지식 분야에도 적용 할 수 있습니다.

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이전에는 DNA 가닥의 시퀀싱이 느리고 비용이 많이 드는 활동으로 간주되어 올리고 뉴클레오티드에서 몇 개의 염기 쌍만 식별 할 수있었습니다.

오늘날 과학의 모든 발전과 함께 DNA 염기 서열 분석은이 분야에서 거의 50 년의 연구에 기여한 덕분에 전 세계 많은 실험실에서 일상적인 작업입니다. 체인 길이 측면에서 매우 짧은 시간에 최대 수백만 개의 염기쌍을 배열 할 수 있습니다.

이를 위해 가격과 정밀도가 다른 수십 가지 기술이 개발되었습니다. 이 기사에서는 각각 장점과 단점이있는 고전 기술과 현대 기술을 모두 설명합니다.

지금까지 시퀀싱 기술을 사용하면 작은 원핵 생물과 효모에서 인간 게놈에 이르기까지 완전한 게놈의 서열을 얻을 수 있습니다.

DNA 구조

DNA 시퀀싱에 사용되는 방법과 기술을 이해하려면 분자 구조 및 구성의 특정 핵심 측면을 알아야합니다.

DNA는 박테리아에서 대형 수생 동물에 이르기까지 모든 생물에서 발견되는 생체 분자입니다. 미토콘드리아 및 엽록체와 같은 세포 기관은 내부에 원형 DNA 분자를 가지고 있습니다. 일부 바이러스에서도 발견되는 유전 물질은 DNA입니다.

구조적으로 DNA는 뉴클레오티드 모음입니다. 각각은 탄수화물, 질소 염기 (A, T, C 또는 G) 및 인산염 그룹으로 구성됩니다. DNA 염기 서열 분석의 목표는 염기 서열에서 4 개의 질소 염기가 발견되는 순서를 밝히는 것입니다.

역사

1950 년대 중반 왓슨과 크릭 연구원은 기독교 기술을 사용하여 DNA의 구조를 설명했습니다. 그러나이 연구자들 중 누구도 시퀀스를 풀 수있는 방법을 찾지 못했습니다.

특정 전임자들이 있었지만 가장 중요한 사건은 1977 년 생거 방법의 창안이었습니다.이 방법의 아버지 인 프레드릭 생거는 영국의 생화학 자였으며 생물학에 대한 막대한 공헌으로 두 개의 노벨상을 수상했습니다.

이 기술은 문헌에서 "사슬 종결"또는 디데 옥시 뉴클레오티드로도 알려져 있습니다. 이 기술의 원리와 그 개선과 혁신을 기반으로 개발 된 원리는 다음과 같습니다.

Sanger 방법

Sanger 방법의 개발은 분자 생물학에서 중요한 사건을 나타냅니다. 일반적으로 세포에서 발생하는 DNA 복제 과정의 기본 구성 요소를 포함하지만 특수 구성 요소 인 디데 옥시 뉴클레오티드를 추가합니다.

반응의 주요 구성 요소

-DNA 중합 효소 : DNA 중합 효소는 공정의 중요한 요소입니다. 이 분자는 DNA 가닥의 복제에 참여하고 그 역할은 triphosphate deoxyribonucleotides와 상보적인 것의 쌍을 이루는 새로운 가닥의 합성입니다.

DNA에서 티민 (T)은 두 개의 수소 결합을 통해 아데닌 (A)과 쌍을 이루고, 사이토 신 (C)은 세 개의 결합을 통해 구아닌 (G)과 쌍을 이룹니다.

-뉴클레오타이드 : Sanger 시퀀싱은 2 가지 유형의 뉴클레오타이드, 즉 4 개의 2'- 데 옥시 뉴클레오타이드 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP로 약칭)와 4 개의 디데 옥시 뉴클레오타이드 (ddATP, ddGTP, ddCTP 및 ddTTP)를 포함합니다.

디데 옥시 뉴클레오타이드는 일반적으로 DNA에 통합되는 모노머와 유사하지만 구조에 -OH 그룹이 없습니다. 이것은 사슬에 새로운 뉴클레오티드를 추가하는 것을 불가능하게합니다.

따라서 특별한 뉴클레오티드가 형성되는 사슬에 완전히 무작위로 추가되면 합성이 마비됩니다. 따라서 반응이 끝날 때 크기가 다른 사슬이 있으며 각 사슬은 반응이 다른 지점에서 중단되었습니다.

실험적으로 네 가지 테스트가 준비됩니다. 각각은 관심있는 생물학적 샘플에서 추출한 DNA, 정상 뉴클레오티드 및 네 가지 특수 뉴클레오티드 유형 중 하나를 포함합니다. 특수 뉴클레오타이드는 일부 유형의 형광 마커로 표시됩니다 (아래 자동 시퀀싱 참조).

결과 읽기

첫 번째 단계는 합성 된 각 체인을 크기에 따라 분리하는 것입니다. 일부는 특수 기지가 통합 된 위치에 따라 다른 것보다 길 것입니다.

크기를 구별 속성으로 사용하여 혼합물의 성분을 분리 할 수있는 다양한 생화학 적 기술이 있습니다. Sanger의 방법에서 다른 사슬은 전기 영동으로 분리됩니다. 기술의보다 정교한 변형에서는 모세관 전기 영동이 사용됩니다.

따라서 긴 가닥은 짧은 변형보다 덜 이동합니다. 이 시스템은 각 디데 옥시 뉴클레오티드에 포함 된 마커를 인식하는 판독기를 통과합니다. 이러한 방식으로 시퀀스의 순서를 알 수 있습니다.

이 "1 세대"기술은 1 킬로베이스 이하의 DNA 조각을 읽을 수 있습니다. 현재 Sanger 방법은 일반적으로 현대적인 변형에서 다양한 실험실에서 사용됩니다. 또한 가장 복잡한 기술로 얻은 결과를 확증하는 데 사용되지만 정확도는 떨어집니다.

자동 시퀀싱

대규모 시퀀싱이 필요한 경우 자동화를 통해 프로세스가 가속화됩니다. 이것은 Sanger 사슬 종결 방법의 변형으로, 프라이머를 구별하기 위해 형광 제품으로 라벨링합니다.

그 후, 반응 생성물은 전기 영동으로 실행됩니다-모두 단일 레인에서. 각 조각이 젤의 마지막 부분을 빠져 나가면 형광 라벨링으로 빠르게 식별되며 1 % 주변 오류가 발생합니다.

가장 정교한 시스템에는 로봇에 연결된 컴퓨터로 관리되는 최대 96 개의 모세관 시스템이 있습니다. 즉, 96 개의 DNA 샘플을 동시에 검사 할 수 있습니다. 따라서 전기 영동 및 결과 분석을 포함한 프로세스가 완전히 자동화됩니다.

하루에 이러한 시스템은 최대 550,000 개의 염기를 시퀀싱 할 수 있습니다. 이 과정에서 인간의 노동이 필요하지 않으며 방법을 시작하는 데 약 15 분이 소요됩니다.

Maxam-Gilbert 시퀀싱

Sanger가 자신의 연구를 발표 한 동시에 Allan Maxan과 Walter Gilbert라는 두 명의 연구원이 DNA 서열을 얻기위한 또 다른 방법을 개발하는 데 성공했습니다. 이 방법은 당시 인기를 얻었지만 나중에 Sanger의 방법의 개선으로 대체되었습니다.

Sanger 방법과는 달리 Maxan 및 Gilbert 시퀀싱 (또는 알려진 화학적 시퀀싱)은 혼성화 반응을 포함하지 않습니다. 방법론은 한쪽 끝에 반응성 제제를 사용한 라벨링과 정제 공정으로 구성됩니다.

이 기술의 부정적인 측면 중 하나는 엄청난 복잡성과 사용자에게 위험한 화학 물질의 사용에 있습니다. DMS, 포름산, 히드라진 및 히드라진을 염과 함께 적용하면 화학적 파손이 유발됩니다.

방법

프로토콜은 인 마커 (32)로 가닥의 5 '말단에서 라벨링으로 시작하고, 질소 염기의 화학적 변형이 일어나고 분리됩니다. 마지막으로 비염 기성 영역의 절단이 발생합니다.

먼저 시퀀싱하려는 문자열을 더 작은 세그먼트로 줄입니다. 이 단계는 제한 효소로 수행되어 끝이 돌출됩니다.

다음으로 알칼리성 포스파타제를 사용하여 반응을 수행하며, 그 목적은 인산기를 제거하는 것입니다. 따라서 폴리 뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 표지를 수행 할 수 있습니다.

체인이 변성됩니다 (두 가닥이 열림). 그런 다음 화학 물질이 적용됩니다. 이러한 절단 반응은 제어 된 방식으로 수행되며, 각각의 화학적 절단을 적용한 결합 유형이 알려져 있습니다.

결과 읽기

Sanger 방법에서와 같이 결과 읽기에는 전기 영동 시스템에서 얻은 사슬의 크기에 따른 분리가 포함됩니다. 폴리 아크릴 아미드로 구성된 시스템을 사용하면 겔을 읽는 데 매우 적절한 분해능을 얻을 수 있습니다.

대량 시퀀싱

대규모 시퀀싱은 영어 "Next Generation Sequencing"에서 NGS로 축약 된 일련의 새로운 방법을 포함합니다.

NGS로 분류 된 방법은 이전 DNA 증폭 단계가 필요합니다 (단일 분자에서는 작동하지 않음). 또한 사용되는 플랫폼은 매우 다양합니다. 가장 많이 사용되는 방법의 원리는 다음과 같습니다.

파이로 시퀀싱

여기에는 새로운 뉴클레오티드가 DNA 가닥에 추가 될 때마다 발생하는 피로 인산염의 방출을 모니터링하는 것이 포함됩니다. 효소 시스템이 결합되어 새로운 뉴클레오티드가 포함될 때마다 빛의 방출 (카메라로 감지 가능)이 발생합니다.

이 과정은 각 질소 염기의 개별 배양으로 시작하여 발광 여부를 확인합니다. Pyrosequencing은 긴 가닥을 읽을 수 있지만 발견 된 오류율은 높습니다.

합성 시퀀싱

이것은 표지 된 뉴클레오티드의 통합을 포함합니다. 이러한 형광 성분이 추가되고 세척되고 통합 된 뉴클레오티드가 기록됩니다. 그런 다음 뉴클레오티드 라벨이 제거되고 가닥의 합성이 계속 될 수 있습니다. 다음 단계에서 표지 된 뉴클레오티드도 통합 될 것이며, 앞서 언급 한 단계가 반복 될 것입니다.

이 기술의 단점은 형광 마커가 완전히 제거되지 않을 때 발생합니다. 이러한 방출은 배경 오류를 생성하여 심각한 오류를 초래합니다.

결찰 시퀀싱

이 기술은 DNA 중합 효소를 사용하지 않기 때문에 다른 기술과 다릅니다. 대신이 방법론의 핵심 효소는 리가 아제입니다. 여기에서는 형광 표지 된 DNA 단편을 사용하여 효소에 의해 연결되어 검출됩니다.

이 기술의 가장 큰 문제점은 처리 할 수있는 단편 길이가 짧다는 것입니다.

이온 토런트 시퀀싱

이 기술은 새로운 뉴클레오티드가 포함될 때마다 방출 되는 H ⁺ 이온의 측정을 기반으로합니다 . 원리는 파이로 시퀀싱과 매우 유사하지만 훨씬 저렴합니다.

예

인간 게놈의 시퀀싱

인간 게놈 시퀀싱은 생물학에서 가장 유망한 과제 중 하나 였을뿐만 아니라 과학 역사상 가장 찬사를받는 경쟁자 중 하나였습니다. 사실, 프로젝트에 참여한 과학자들에게 게놈 시퀀싱은 경쟁이되었습니다.

1990 년에 그는 유명한 과학자 노벨상 수상자 제임스 왓슨이 이끄는 "인간 게놈 프로젝트"를 시작했습니다. 1 년 후인 1991 년에 Venter는 Watson을 "이길"도전하고 그 앞에있는 게놈을 시퀀싱합니다. 그러나 1992 년 Watson은 은퇴하고 다른 연구원이 명령을 맡았습니다.

1995 년 Venter는 무작위 시퀀싱 방법에 의한 세균 게놈의 완전한 시퀀싱에 성공했다고 발표했습니다. 마찬가지로 반대 팀은 1 년 후 효모 게놈의 염기 서열 분석을 발표했습니다.

2000 년에 학위가 종료되었습니다. 두 회사 모두 예비 전체 게놈 결과를 과학에서 가장 권위있는 두 저널 인 Nature와 Science에 발표했습니다.

그러나 과학자들은 제안을 개선하기 위해 계속 노력했으며 2006 년에 특정 인간 염색체의 서열이 완성되었습니다.

중요성 및 응용

DNA와 같은 중요한 분자의 뉴클레오타이드 순서를 아는 것은 생물 학자와 관련 전문가에게 중요합니다. 이 폴리 뉴클레오타이드 사슬에는 모든 형태의 생명체를 개발하고 유지하는 데 필요한 모든 정보가 포함되어 있습니다.

이러한 이유로이 서열에 대한 지식은 생물학적 연구에 필수적입니다. 기본적으로 시퀀싱을 사용하면 생물학적 시스템의 가장 중요한 특성 중 하나를 측정하고 이들 간의 차이점을 설정할 수 있습니다.

특정 DNA 서열을 사용하면 두 유기체가 동일한 종에 속하는지 여부를 판단하는 기준을 설정할 수있을뿐만 아니라 이들 간의 계통 발생 관계에 대한 가설을 제안 할 수 있기 때문에 분류 학자와 체계 학자가 염기 서열 분석을 널리 사용합니다.

또한 DNA 시퀀싱은 의학 및 진단 분야에 적용됩니다. 예를 들어, 시퀀싱을 통해 소위 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)을 사용하여 특정 질병 (예 : 암)이 발생하는 경향을 평가할 수있는 저렴하고 접근 가능한 시스템이 있습니다.

범죄에 대한 특정 개인의 참여에 대한 신뢰할 수있는 증거로 사용할 수있는 시퀀싱 기술로 범죄 및 법의학 조사도 강화되었습니다.

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